ISS N 100727626C N 1123870ΠQ中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology2005年12月21(6):732～736・综述・文库筛选与分子进化的核糖体展示新方法袁 青, 夏玉先, 殷幼平, 胡 浩, 王中康3(重庆大学生物工程学院,重庆市基因功能与调控重点实验室,重庆 400030)摘要 利用适当的文库筛选技术快速、简便地从DNA 文库、随机肽库、抗体库或其它蛋白文库中筛选生物活性物质是目前分子生物学研究的一个热点.核糖体展示是一种完全离体进行的功能蛋白筛选和进化鉴定的新技术,避免了传统的活体筛选技术的缺陷,使得文库容量增大、分子多样性加强.本文系统地评述了核糖体展示技术在制备ScFv 单链抗体方面的应用,包括ScFv 单链抗体模板的构建、体外转录与体外翻译、亲和筛选及筛选效率的测定以及分子多样性和体外进化研究,讨论了核糖体展示技术目前的发展动态、存在问题及发展趋势.关键词 核糖体展示,mRNA 2核糖体2蛋白复合体,筛选,ScFv 中图分类号 Q75A N ovel Technique Ribosome Display for Selection from Librariesand Evolution of MoleculesY UAN Qing ,XI A Y u 2X ian ,YI N Y ou 2Ping ,H U Hao ,W ANG Zhong 2K ang3(College o f Bioengineering ,Chongqing University ,K ey Laboratory o f G ene Function and Regulation o f Chongqing ,Chongqing 400030,China )Abstract It is a hotspot nowadays in the m olecular biology research domain to use appropriate techniques ,which should be rapid and convenient ,to screen target m olecules with bioactivity from DNA library ,random peptide library ,antibody library and other protein libraries.Ribos ome display is a novel technique for functional proteins selection ,identification and ev olution which is performed totally in vitro .Thus this approach av oids several limitations of in vivo cellular display and has advantages of enlarged capability of library and enhanced diversity of target m olecules.The paper reviewed the applications of preparation of the ScFv antibody by ribos omal display ,including construction of the ScFv tem plate ,transcription and translation in vitro ,selection and evaluation of high 2affinity antibodies from com plex libraries ,increasing the m olecular diversities and ev olution in vitro by ribos ome display ;as well as the application status ,the unres olved questions and promising prospect of ribos omal display.K ey w ords ribos ome display ,mRNA 2ribos ome 2protein com plexes ,screen ,ScFv收稿日期:2005203226,接受日期:20052072063联系人 T el :023*********,E 2mail :zkwang @Received :M arch 26,2005;Accepted :July 6,20053C orresponding author T el :023*********,E 2mail :zkwang @ 克隆展示技术(cloning display )是一种筛选蛋白质的强有力工具,该技术将基因型和蛋白表型联系在一起,利用目标蛋白的特异性配基可从蛋白质展示文库中筛选出目标蛋白并找到相应的基因序列.过去,展示技术必须依赖细胞,如噬菌体展示(phage display )、细菌表面展示(bacterial surface display )、酵母表面展示(yeast display )等.由于受细菌转化效率、噬菌体包装、跨膜分泌和蛋白酶降解等限制因素影响,库容量及其分子多样性都受到限制.20世纪90年代中期发展起来了一种体外展示技术———核糖体展示(ribos ome display ),由于该技术完全在体外进行,弥补了细胞内展示的不足.因此,能显著增加库容量及分子多样性,其中库容量可达1013～1015,比噬菌体展示文库(约109)提高了104～106倍[1,2].此外,核糖体展示技术简便的建库和筛选方法,无需选择压力,通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力等优点,使核糖体展示技术显示出了诱人的发展前景.本文从核糖体展示技术的发展,原理和应用方面加以全面的评述,并对存在的主要问题的解决途径和发展趋势作了简介.1 核糖体展示技术的发展与研究动态20世纪70年代和80年代早期,一些研究小组利用免疫沉淀法从细胞内的“mRNA2核糖体2蛋白质”复合体中分离特殊的mRNA分子,并获得成功[3].到90年代,通过一系列研究发现,当mRNA缺乏终止密码子并经过适当修饰后,可以形成十分稳定的“mRNA2核糖体2蛋白质”三元复合体,这种复合体可以将蛋白质和mRNA信息连接到一起.而一些体外无细胞体系如兔网织红细胞裂解液、E.coli裂解液和麦胚提取物中存在高浓度的核糖体,为小体积中合成蛋白质提供了必要条件[4].应用核糖体表面展示进行特殊功能的肽和蛋白质筛选,已逐渐成为可能.1997年,Plückthun实验室在前人研究的基础上,对Mattheakis(1994)的多聚核糖体展示技术进行了改进,建立了体外筛选完整功能蛋白的新技术———核糖体展示技术[5].其基本原理是:在体外, DNA转录后,转录产物mRNA(翻译模板)不含终止密码子,翻译过程中核糖体会停留在mRNA的3′末端,从而形成以非共价键连接的“mRNA2核糖体2蛋白质”三元复合体,然后即可进行体外目标蛋白筛选,如Fig.1A.核糖体展示技术自1997年发展以来,已广泛应用于各种文库筛选及分子进化实验中.He 应用此技术筛选了抗黄体酮ScFv单链抗体[6,7];此后,Y au应用此技术从未变异文库中筛选了半抗原专化性单结构域(single2domain)抗体[8];Lee筛选了抗H BV DNA聚合酶的专一性ScFv单链抗体[9].另外,R oberts[10]和Nem oto[11]分别独立设计了一种与核糖体展示类似,称为mRNA2多肽融合技术或体外病毒(in vitro virus)的技术,Fig.1B.即在mRNA的3′末端连入一个嘌呤霉素标记的DNA linker片段,体外翻译时核糖体会停在DNA linker与RNA之间的连接处,嘌呤霉素进入核糖体A位点,并在肽酰转移酶的作用下与天然多肽偶联.多肽2嘌呤霉素2mRNA 复合物与核糖体解离后,直接用于亲和性筛选.其中,mRNA与DNA linker2嘌呤霉素片段连接的方法有三种,一种是splint DNA连接法,采用splint DNA (其两端分别与linker的5′端和mRNA的3′端序列互补的寡核苷酸链)在T4DNA连接酶的作用下将上述两者连接起来[12];第二种是补骨脂素(ps oralen)连接法,首先要求linker的5′端和mRNA的3′端互补杂交,然后linker5′端携带的补骨脂素在紫外光的作用下进一步与mRNA共价连接,以增强连接的稳定性[13];第三种是Y连接法,即分别在linker的5′端Fig.1 In vitro display technologies[17](A)Schematic representation of a ribos ome display selection round.(B)Schematic representation of a mRNA display selection round和mRNA的3′端设计一段序列,然后两者在T4DNA 连接酶或T4RNA连接酶的作用下以茎环结构(Y2 ligation loop)连接,T abuchi认为,这种方法的连接效率更高[14].针对mRNA不稳定,易被RNA酶降解, K urz和T abuchi在对mRNA2多肽融合技术改进的基础上,提出了cDNA2蛋白质融合技术.即体外翻译后,将mRNA反转录为cDNA,形成的融合cDNA2蛋白质可在严谨条件下进行筛选[15,16].核糖体展示技术与mRNA2多肽融合技术基本原理类似,只是后者利用了嘌呤霉素将mRNA与多肽以共价键的形式联系起来,从而避免了核糖体展示中因缺少稳定的共价键使得核糖体三元复合物不够稳定的问题;另外mRNA2核糖体2多肽三元复合物中的核糖体由于分子量较大可能会影响靶标蛋白的筛选,导致高亲和力靶标分子的丢失,而mRNA2融合技术避免了此类问题,更适合于严谨条件下(如高温)靶标分子的筛选.目前,核糖体展示技术和mRNA融合技术都已337第6期袁 青等:文库筛选与分子进化的核糖体展示新方法 广泛应用于线型多肽工程文库、限制性多肽文库、抗体文库中高亲和力分子[18,19]及小分子药物的选择[20],但在ScFv 单链抗体方面,核糖体展示技术应用得更为广泛,应用核糖体展示技术已筛选出许多高亲和力的ScFv 单链抗体.2 核糖体展示技术在制备ScFv 单链抗体方面的应用2.1 ScFv 单链抗体模板的构建构建的ScFv 单链抗体模板由4部分组成:5′非编码区,单链抗体编码区,间隔区(spacer )序列和3′非编码区(如Fig.2).5′非编码区包括T7启动子序列、Shine 2Dalgarno 序列(来源于T7噬菌体的基因10)以及能够形成茎环结构(该结构能够有效地保护mRNA 模板免遭RNase E 的降解)的一段反向重复序列[21].3′非编码区也存在一段反向重复序列,来源于大肠杆菌脂蛋白的终止子或T3噬菌体的早期终止子,可以在mRNA 水平形成茎环结构,3′茎环结构对于保护mRNA 不被E .coli S30提取物中的3′25′2核酸外切酶降解起重要作用.上述两种茎环结构加入后,核糖体展示效率会提高15倍[22].翻译时核糖体在多肽链上大约占据20～30个氨基酸的空间位置.为了避免影响抗体的空间构象,并为抗原抗体结合反应提供足够的弹性空间,在模板的编码区除单链抗体编码序列之外还需一段间隔序列.Hanes 和Pl ückthun [23]利用噬菌体M13基因Ⅲ的部分编码序列(编码88～116个氨基酸)作为间隔序列,发现核糖体展示的效率随着间隔序列的长度增长而增加.Schaffitzel 等[24]以E .coli 的T onB 作为间隔序列,成功地展示出ScFv.此外,抗体轻链恒定区κ结构域也可被用作间隔区,用于ScFv 抗体片段的核糖体展示[7].然而,对于使用这些不同的间隔序列与最初的基因Ⅲ间隔有何不同有待细致深入的研究[25].Fig.2 The scFv construct used for ribos ome display2.2 体外转录与体外翻译体外表达可以利用来自原核的E .coli S30无细胞蛋白质合成系统,也可以利用真核的兔网织红细胞裂解液和麦胚提取物的蛋白质合成系统,至于何种系统更适合,目前尚有争议[25].体外转录与体外翻译可以偶联进行,也可以分别进行.目前,已有以DNA 为模板的体外蛋白翻译系统和以RNA 为模板的体外转录与翻译偶联的商用系统问世.对于含二硫桥的ScFv 抗体和其他蛋白质,转录和翻译应分别进行,因为含有二硫桥的蛋白质需要在氧化条件下才能正确折叠,但转录时,T7RNA 聚合酶要求具还原性的β-巯基乙醇维持其稳定性[23].He 和T aussig 采用转录与翻译偶联进行的兔网织红细胞裂解物体外表达体系成功进行了单链抗体的核糖体展示,但这种方法仅适合于少数抗体[7].如果目标蛋白在还原性条件下能正确折叠,则体外转录Π翻译偶联体系效果可能更好.体外转录Π翻译偶联的表达体系中,持续转录使产生的mRNA 水平非常稳定,如果体外转录与体外翻译分别进行,则需要控制RNase 的影响.VRC ———过渡态类似物———作为RNase 抑制剂,能有效抑制核酸酶,提高E .coli 核糖体展示效率[23].翻译结束后立即冷却反应混合物,所有筛选步骤都在冰上进行也可以降低RNase 的影响.另外,3′端和5′端的茎环结构也可以使mRNA 避免核酸外切酶RNase Ⅱ和核酸内切酶RNase E 的影响[25].2.3 亲和筛选及筛选效率的测定体外翻译反应结束后,将翻译混合物稀释4倍终止反应.筛选过程在冰上进行,反应试剂中始终保持5mm ol ΠL Mg 2+浓度,这样能稳定mRNA 2核糖体2蛋白质三元复合体.稀释后的翻译混合物可以直接用于筛选实验,也可以于4℃保存,核糖体复合物在4℃至少可以稳定10d ,但产量会逐渐减少.体外筛选时加入1%～2%脱脂奶粉和012%肝素可以降低抗原2抗体的非特异性反应,肝素还能抑制核酸酶.亲和筛选分为固相筛选和液相筛选,主要有E LIS A 和磁珠法.Hanes 等[26]认为,E LIS A 方法中,抗原包被在塑料表面上,而塑料表面的疏水作用有可能会影响吸附蛋白的空间构象,从而导致筛选出的抗体分子不能识别抗原的天然表位;而磁珠法不会出现此类问题.磁珠法是在抗原上连接捕获标签,如生物素,然后在形成抗原2抗体复合物后,采用磁珠2链霉亲和素捕获该标签,进行亲和筛选.E DT A 能螯合Mg 2+使mRNA 2核糖体2蛋白质三元复合体解离,筛选完成后,加入含20mm ol ΠL E DT A 的冰冷缓冲液洗脱mRNA.洗脱下来的mRNA 用DNase Ⅰ处理去除残留的DNA 模板后,进行RT 2PCR 反应重新引入T7启动子,S D 序列等核糖体展示必437中国生物化学与分子生物学报21卷需元件用于下一轮展示或直接进行Northern杂交,评价筛选效率.将最后一轮筛选到的靶标基因与质粒连接,转化到大肠杆菌中,可以得到单个靶标克隆.筛选效率的评价可以根据每轮展示后洗脱得到的mRNA、反转录扩增的cDNA、cDNA体外转录翻译得到的蛋白质产量进行分析.Matteakkis等[5]在体外转录、翻译过程中加入[α232P]UTP标记mRNA和核糖体复合物,亲和筛选后将分离得到的mRNA与空白组进行放射性强度比较,判断每轮筛选的富集效果;Hanes等[23]在体外翻译过程中用[35S]蛋氨酸标记蛋白质,对翻译后的复合物进行RI A分析,得到每轮筛选后特异性靶蛋白的富集效果.Jermutus等[27]利用荧光相干光谱法(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)对核糖体复合物进行定量分析,判断每轮筛选的富集效果.另外,用BI Acore xΠ3000将每次翻译得到的产物与抗原进行相互作用分析,可以通过测定抗原抗体作用的亲和常数和解离常数来判定筛选后的抗体亲和力是否得到提高.2.4 体外分子进化用核糖体展示技术对未变异的文库进行筛选时,可以通过有性PCR(sexual PCR)、错误倾向PCR (error2prone PCR),例如使用低保真性DNA聚合酶,寡核苷酸介导的诱变,在非物理性金属离子(如Mn2+)或dNTP类似物存在条件下的易错PCR、DNA 重排(DNA shu ffering)等方法引入突变和重组技术,增加分子多样性,从而提高获得高亲和力、良好稳定性或增加酶活性靶标分子的机率.Plückthumx小组利用核糖体展示技术筛选到111nm ol高亲和力的ScFv,之后通过引入DNA重排技术,又将其亲和力提高了30倍,得到了40pm ol亲和力的ScFv[28].3 存在的问题及展望核糖体展示技术由于完全在体外进行,具有建库简单、库容量大、分子多样性强、筛选方法简便、无需选择压力,还可通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力等优点,是一种筛选大型文库和获取分子进化强有力的方法.但仍然存在一些机制问题有待解决.首先,核糖体展示和mRNA2多肽融合技术都需要绝大多数核糖体能将蛋白质翻译完全以使其能够正确折叠,这是筛选成功的关键之一.然而在体外翻译时,虽然大部分新生肽链在离开核糖体之前已经翻译完全并正确折叠,但还有少部分不是这样,那么后者就会引入不正确的折叠产物,限制靶标分子的富集,增加筛选的非特异性.另外,在mRNA融合技术中从核糖体中纯化蛋白质2嘌呤霉素2DNAΠmRNA还存在一些疑惑.因为翻译的蛋白质在核糖体通道的一端折叠为球形结构域,而在通道的另一端,嘌呤霉素2mRNAΠDNA与多肽相连,这样纯化蛋白质2嘌呤霉素2DNAΠmRNA就需要核糖体解体,但是至今还没有直接证据证明有这种现象发生.对于这个问题有另外两种解释:一是由mRNAΠDNA 脱离通道;另外一种解释是球形蛋白质发生变性脱离通道.如果需要展示的蛋白质发生变性,可能会限制mRNA融合技术在筛选具有稳定重折叠特性蛋白方面的应用[29].相信随着对核糖体展示技术的进一步研究,以上问题将逐步得到解决,核糖体展示技术作为一种新兴的克隆展示技术,必将在蛋白质相互作用研究、新药开发以及蛋白组学等方面显示出更为广泛的应用空间.参考文献(R eferences)1 Smith G P,Petrenko V A.Phage display.Chem Rev,1997,97:391～4102 Hanes J,Jermutus L,W eber2Bornhauser 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