国内外进展情况、研究目的及意义
非典型肺炎是一种传染性极强的严重急性呼吸道综合症状（Severe acute respiratory syndrome, SARS），主要表现为高热、干咳、胸闷、头痛、关节酸痛、全身乏力、腹泄等症状。据世界卫生组织（WHO）正式确认，SARS是由冠状病毒的一个变种(SARS)引起的。SARS病毒是一种从未在人体发现过的全新的变种病毒，因此人类至今对其认识还很有限，对SARS病毒引起的非典型肺炎也还缺乏有效的治疗药物和措施。由于SARS发病急、传染性强，疫性发展快，因此成为当前国内外重点预防和治疗的传染性疾病。我国政府已将SARS列入法定管理传染病，采取了一系列重大措施。做好SARS的防治工作直接关系到广大人民群众的身体健康和生命安全，关系到我国改革发展稳定的大局。从我国目前对SARS防治的情况看，SARS是可以预防也可以治疗的。既然SARS是传染病，对它的预防就显得十分重要，从某种意义上看，防大于治。目前对SARS的预防方法很多，其中中医药的预防占了很重要的位置。根据中医理论，SARS属于“温病”范畴，病因为感受疫毒时邪，病位在肺。基本病机为热毒痰瘀，壅阻肺络，热盛邪实，湿邪内蕴，耗气伤阴，甚者会出现气急喘脱的危象。因此，对该病的预防则需重在益气化湿，清热解毒，疏风透邪。本课题拟选用国家中医药管理局制定的《非典型肺炎中医药防治技术方案》中预防用中药处方（生黄芪，败酱草，薏苡仁，桔梗，生甘草），对其进行初步的中药药理学研究，并与目前市面较流行的抗病毒中药板蓝根制剂对比。本课题的研究目的是要明确中药预防SARS复方在
增强机体免疫功能、抗病毒、改善机体状态等方面的作用，为中医药抗SARS的应用提供科学的依据，也为预防SARS中药的选用提供药理学依据。
四、研究内容及方法（研究对象、方法及技术路线）
(一)研究内容:1．中药复方对机体免疫功能的影响2．中药复方的解热作用3．中药复方对病毒感染动物的保护作用
(二)实验方法：实验参照《中药药理实验方法学》（陈奇主编）,设立空白对照组中药复方高、低剂量组、板蓝板对照组，所有实验数据采用SPSS统计软件进行处理。预SARS中药处方组成：生黄芪10 g，败酱草15 g，薏苡仁15 g，桔梗6 g，生甘草3 g选自国家中医药管理局制定的《非典型肺炎中医药防治技术方案》中药制备：将上述中药按比例配方，水煎煮两次，合并药液浓缩到所需浓度。给药方法：灌胃给药（ig）
1小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的测定
原理:噬细胞具有吞噬异物,处理抗原等多种功能.鸡红细胞作为一种
异物(或抗原)注入小鼠腹腔后,巨噬细胞会将其吞噬并进行消化,卵育一定时间后观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的数量,可反映机体非特异性免疫功能状态.
方法:取20只小鼠,随机分为2组,给药组每只小鼠按0.2ml/10g(体重)...水煎液灌胃,对照组为等容积生理盐水,共10日.末次给药1h后每鼠腹腔注射5%鸡红细胞0.4ml,10~14h后用劲椎脱臼法处死小鼠,仰位固定于鼠板,消毒腹部,前开腹部皮肤,注入生理盐水2ml,轻揉腹部,1min后抽出腹腔洗液1ml,滴涂于干净载玻片上.每片2ml,共2片,放在垫有湿纱布的搪瓷盆中,置37°c温箱内孵育30min,取出玻片用生理盐水漂洗,以除去未巾片的细胞,冷风吹干,1:1丙酮-甲醇固定5min,再用4%姬姆萨瑞特氏液染色5~10min,蒸馏水漂洗,晾干.在油镜下观察并计算巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数:吞噬百分率=吞噬鸡红细胞巨噬细胞数/100个巨噬细胞
吞噬指数:被吞噬鸡红细胞数/100个巨噬细胞
2.小鼠脾淋巴细胞花结形成试验
原理:淋巴细胞表面具有受体,可与不同种动物的红细胞结合,形成玫瑰瓣样的细胞团,称为玫瑰花结(RFC),而此形成率的高低,常可反映机体细胞免疫功能的强弱,故可作为药物影响免疫功能的指标之一.
方法:取雄性小鼠20只,随机分为三组(..生理盐水组),每只小鼠腹腔注射5%绵羊红细胞(SRBC)0.4ml(约4 亿个SRBC),1 次免疫后,接着按组分别以0.4ml/20g量给与水煎剂及生理盐水灌胃,每日1 次,连续4
次.末次给药后1小时处死小鼠,取出脾脏,按组分放,称重后放入平皿,剪成米粒大小,用Gey's液洗涤3次,用吸管将脾小粒移入瓦管捻转,使碎离成脾细胞.加入pH为7.6的Gry's液2ml混匀,以细胞吸管取上层液,再将沉淀的组织块反复研磨,使能分散混悬于上层液,合并脾细胞悬液,静置5分钟使小块组织下沉,吸取上层液,以1000rpm离心3次,第一次10分钟,第2,3次为5分钟均在离心后弃去上层液(内含血浆成分,细胞碎片等).最后1次弃去上清液后,加入Gry's液2ml,取部分进行细胞计数,加1%台盼蓝检查活细胞数(一般为80~95%).以上操作过程均应在冰水浴中和无菌条件下进行.
将上述脾细胞悬液稀释成8×106个细胞/ml.取0.1ml加入1%SRBC及经SRBC吸取过的灭活小牛血清各0.1ml混匀,以1000rpm离心10分钟后放入4°C冰箱2 小时,然后每管加入1%甲苯蓝20µl染色.用尖咀吸管轻轻分散沉积细胞,再将均匀的细胞悬液滴于血球计数盘上,盍上盍玻片,在高倍镜下计数特异玫瑰花结形成的百分率。
3大鼠发热试验：干酵母致热法
原理:酵母混悬液皮下注射于大鼠,先引起动物体温下降,一段时间后动物体温明显升高,并持续较长时间,局部有明显炎症,动物全身表现与临床伴内脏或皮肤有明显炎症的里热证类似,故可用此作为发热动物模型以研究动物特别是清热药的解热功效...对此有明显的抑制作用.
方法:1.酵母悬液制备:称取干酵母10g,置于报乳钵中,逐渐加入蒸馏水为均匀悬浆,最后定容为50ml(20%),此液须于临用前配制.
2.大鼠准备:大鼠于实验室环境适应3~4日,每日用水银体温计从肛内测体温1~2次,实验当日每小时测体温1次,连续2~3次,选取体温变化不超过0.3°C的动物供实验用.
3.实验:将合格大鼠随机均分若干组,分别灌服不同剂量的药物或黄芪胶悬液(对照组),给药后各鼠立即于背部皮下注入20%酵母悬液10ml/kg,然后于0.5,1,2,4,6,8,10及12小时各测大鼠体温一次.
4.病毒感染小鼠的死亡中保护试验
原理:用流感病毒鼠肺适应株滴鼻感染小鼠,可使发生肺炎而互死亡,以动物的死亡率和存活时间,可作为观察药物有无抗病毒作用的指标. 材料:动物:小鼠.病毒毒种:流感病毒亚甲型FM1鼠肺适应株.器材:灭菌的小试管,药品及试剂:
方法:1.稀释病毒:用肉汤将病毒毒种稀释成2个LD50/0.05ml,置冰水浴中备用.
2.感染小鼠:选小鼠14~16g健康小鼠,按体重随机分组,于乙醚轻度麻醉下滴鼻感染,每鼠0.05ml.
3.药物防治:于病毒感染前一天开始口饲给药,每天两次,每次0.5ml,直至感染后4天,共给药5天.同时设病毒,药物,阳性和正常对照组等,观察14天,逐日记录动物发病症状和死亡数.
4.计算结果:
