清洁验证分析方法验证

第1页 共8页 一、制定依据：

《药品GMP指南》（口服固体制剂）、《药品生产验证指南》（2003年版）、《中国药典》（2020年版）。

二、内容：

1、术语

1.1清洁

清洁是指设备中各种残留物（包括微生物及其代谢产物）的 总量低至不影响下批产品的规定的疗效、质量和安全性的状态。

1.2方法验证

方法验证系指根据检验项目的要求，预先设置一定的验证内容和验证标准要求，并通过设计合理的实验来验证所采用的分析方法是否符合检验项目的要求。采用非法定分析方法，均应当进行方法验证（方法转移除外）。

2、清洁验证分析方法验证的适用范围、目的和发起时机

表1 清洁验证分析方法验证的适用范围、目的和发起时机

内容 适用范围 目的 发起时机

清洁验证分析方法验证 1.采用新的检验方法；

2.检验方法需变更的。 证明采用的分析方法适合于相应的检测要求。 1.建立分析方法时；

2.变更制剂组分时；

3.修订原分析方法时；

4.残留限度发生改变，超出原验证范围时。

3、清洁验证分析方法验证

3.1清洁验证分析方法验证的一般原则

用于清洁验证的常规检验项目（如性状、pH、电导率、TOC等）的分析方法可豁免方法验证。对于药物残留检测的分析方法，应进行方法验证，方法验证指标包括专属性与系统适用性、检测限、定量限、线性范围、棉签擦拭回收率、淋洗水回收率。

3.2.1专属性与系统适用性试验

3.2.1.1专属性

清洁验证分析方法的专属性主要是考察空白溶剂、阴性样品（空白辅料）、空白棉签在主成分保留时间处是否存在干扰，考察采用的分析方法能否正确测定被测物质。

第2页 共8页 3.2.1.2系统适用性试验

系统适用性试验是考察多次重复测定时，各测定值之间的接近程度。在进行色谱分析方法验证时，应配制100%限度浓度对照品溶液，连续进样6针进行重复性验证，计算保留时间和峰面积（或响应值）的RSD。

3.2.1.3数据要求

专属性试验中，空白溶剂、阴性样品（空白辅料）、空白棉签在主成分保留时间处应无干扰色谱峰，如主成分峰附近有其他色谱峰，分离度应符合要求。

系统适用性试验中，6针保留时间的RSD应不得过1.0%，峰面积（或响应值）的RSD应符合表1中相应浓度的重复性RSD要求。

表1 样品中待测定成分含量与精密度RSD可接受范围

3.2.2检测限（LOD）

检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。对于限度试验和定性鉴别应进行检测限试验，检测限没有定量意义。

根据不同检验方法，可以采用下列不同方法测得检测限。

3.2.2.1直观法

用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

本法主要适用于非仪器分析方法。

3.2.2.2信噪比法

用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样

第3页 共8页 品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的被测物质最低浓度或量。一般以信噪比为3:1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。此外，检测限溶液应连续测定3次，计算峰面积的RSD。

本法主要适用于色谱法。

3.2.2.3基于空白响应值标准偏差和标准曲线斜率法

按照LOD=3.3δ/S公式计算。

式中LOD：检测限；

δ：测定11次空白响应值的标准偏差；

S：标准曲线的斜率。

本法主要适用于光谱法。

3.2.2.4数据要求

应附测试图谱（如有），应说明测试过程和检测限结果。此外，检测限溶液峰面积（或响应值）的RSD应≤20%（n=3）。

3.2.3定量限（LOQ）

定量限系指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应符合准确度和精密度要求。进行清洁验证药物残留量检测前应确定方法的定量限，残留限度在定量限浓度以上时，方可采用此法进行药物残留量检测。

根据不同检验方法，可以采用下列不同方法测得定量限。

3.2.3.1直观法

用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地定量测定的最低浓度或量。

本法主要适用于非仪器分析方法。

3.2.3.2信噪比法

用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地定量的被测物质的最低浓度或量。一般以信噪比为10:1时相应浓度或注入仪器的量确定定量限。此外，定量限溶液应连续测定6次，计算保留时间和峰面积的RSD。

本法主要适用于色谱法。

3.2.3.3基于空白响应值标准偏差和标准曲线斜率法

按照LOD=10δ/S公式计算。

式中LOD：检测限；

第4页 共8页 δ：测定11次空白响应值的标准偏差；

S：标准曲线的斜率。

此外，定量限溶液应连续测定6次，计算响应值的RSD。

本法主要适用于光谱法。

3.2.3.4数据要求

应附测试图谱（如有），应说明测试过程和定量限结果。此外，定量限溶液保留时间的RSD应不得过2.0%，峰面积（或响应值）的RSD应符合精密度项下相应浓度的重复性RSD要求。

3.2.4线性、范围

线性系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈比例关系的能力。

范围系指分析方法能达到精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度或量的区间。

3.2.4.1试验方法

应在设计的范围内测定线性关系。可用同一对照品贮备液经精密稀释，或分别精密称取对照品，制备一系列对照品溶液的方法进行测定，至少制备5个不同浓度水平（可为定量限浓度、限度浓度的25%、50%、100%、150%（或200%）），每个浓度各1份，每份溶液分别测定2次。以浓度为横坐标，峰面积（或响应值）为纵坐标，绘制标准曲线。必要时，峰面积可经数学转换，再进行线性回归计算。

3.2.4.2数据要求

应列出线性图和回归方程y=ax+b，相关系数r≥0.995，|b|/y≤25%（其中b为回归方程的截距，y为x=100%限度浓度时按照回归方程计算的y值）。

3.2.5综合回收率

生产过程中，清洁验证的取样方法有棉签擦拭取样法和淋洗水取样法，其中棉签擦拭取样法适用于最难清洁部位的取样，通过考察有代表性的最难清洁部位的残留物水平来评价整套生产设备的清洁状况。淋洗水取样法适用于不便拆卸或不宜拆卸的设备，擦拭取样不易接触到的表面，尤其适用于设备表面平坦、管道多且长的生产设备。

为保证取样方法的准确性，需对棉签擦拭取样法和淋洗水取样法进行回收率试验。

第5页 共8页 3.2.5.1棉签擦拭回收率

3.2.5.1.1试验方法

3.2.5.1.1.1准备与设备内表面材质相同的板材4块，尺寸为15cm×15cm或其他适宜的尺寸，如平整光洁的316L不锈钢板。

3.2.5.1.1.2计算所要擦拭表面的面积，每个擦拭部位擦拭的面积应以获取残留物的量在检测方法的线性范围内为原则。通常可取25cm2或100cm2。

3.2.5.1.1.3配制适宜浓度的样品溶液和阴性溶液，分别取一定体积的空白溶剂、阴性溶液和样品溶液涂布于上述区域内，空白溶剂和阴性溶液分别涂布1个区域，样品溶液需涂布3个涂布量，分别为50%残留限度或更低、100%残留限度和150%（或200%）残留限度，每个涂布量分别涂布3个区域。

3.2.5.1.1.4自然挥干或用吹风机温和地吹干。

3.2.5.1.1.5用适宜的溶剂润湿棉签，并将其靠在溶剂瓶口挤压以除去多余的溶剂。将棉签头按在取样表面上，用力使其稍弯曲，平稳而缓慢地擦拭取样表面，在向前移动的同时将其从一边移到另一边，擦拭过程应覆盖整个表面。翻转棉签，用另一面同法擦拭同一方块区域，但与前次擦拭移动方向垂直（如下图所示），每擦拭一个方块区域后更换棉签。

一个区域擦拭棉签的数量需要经过验证确定，以满足回收率要求。

3.2.5.1.1.6擦拭完成后，将棉签放入试管中，盖紧密封，并注明样品信息。

3.2.5.1.1.7在上述试管中分别加入预定溶剂2～20ml（加入量以保证供试品溶液中待测成分浓度在线性范围内为宜），超声适宜时间以提取棉签中的残留物，分别制得棉签擦拭空白溶液、棉签擦拭阴性溶液和各浓度供试品溶液。

3.2.5.1.1.8用上述经验证的分析方法检验，对照品溶液（1）连续进样5针，对照品溶液（2）连续进样2针，棉签擦拭空白溶液、棉签擦拭阴性溶液和各浓度供试品溶液各进样1针，记录色谱图，计算待测成分回收率及平均综合回收率，并计算回收率RSD。

第6页 共8页 3.2.5.1.2数据要求

棉签擦拭空白溶液和棉签擦拭阴性溶液在待测成分主峰位置应无干扰，各浓度供试品溶液单个回收率≥70%，平均综合回收率≥70%，RSD≤10.0%（n=9）。

注意：擦拭取样过程的验证实际上是对棉签和溶剂的选择、取样人员的操作、残留物转移到棉签的方法、棉签上残留物提取方法的全面考察。验证过程应注意如下内容：

（1）棉签的选择：应能被擦拭溶剂良好的润湿；有一定的机械强度和韧性，并不易脱落纤维；能与擦拭溶剂和提取溶剂相兼容，不对残留物检测产生干扰。

（2）润湿棉签溶剂的选择：擦拭溶剂不得在设备上遗留有毒物质；应使擦拭取样有较高的回收率；不得对残留物的检测产生干扰。

（3）应由实施清洁验证时的取样人员进行擦拭取样方法验证，以保证实施清洁验证时擦拭的操作与验证时完全一致。

（4）应按照预先开发并经验证的方法进行检验。

3.2.5.2淋洗水回收率

3.2.5.2.1试验方法

3.2.5.2.1.1准备与设备表面材质相同的板材4块，尺寸为15cm×15cm或其他适宜的尺寸，如平整光洁的316L不锈钢板。

3.2.5.2.1.2选定涂布区域，通常可取25cm2或100cm2。

3.2.5.2.1.3配制适宜浓度的样品溶液和阴性溶液，分别将空白溶剂、阴性溶液和样品溶液涂布于上述选定的区域内，空白溶剂和阴性溶液分别涂布1个区域，样品溶液需涂布6个区域（样品涂布量为残留限度×冲洗液体积）。

3.2.5.2.1.4自然挥干或用吹风机温和地吹干。

3.2.5.2.1.5分别用50ml注射器逐次吸取适宜的溶剂（常用水）500ml～2000ml冲洗上述涂布区域，每一区域的冲洗液分别合并至烧杯中，混匀，分别制得空白冲洗液、阴性样品冲洗液和供试品冲洗液。

3.2.5.2.1.6用上述经验证的分析方法检验，对照品溶液（1）连续进样5针，对照品溶液（2）连续进样2针，空白冲洗液、阴性样品冲洗液和供试品冲洗液各进样1针，记录色谱图，计算回收率及平均综合回收率，并计算回收率RSD。

3.2.5.2.2数据要求

空白冲洗液和阴性样品冲洗液在残留物主峰位置应无干扰，各浓度供试品溶