淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

实验6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作 用的检测
遇碘显蓝色 α—淀粉酶
遇碘显红色
淀粉 糊精 取自枯草杆菌，
最适pH为5.5～7.5，
最适温度50～75 ℃
β—淀粉酶
糖化淀粉酶
葡萄糖
麦芽糖
遇碘不显蓝色
遇碘不显蓝色
实验步骤
⒈α- 淀粉酶的固定化。
5ml注射器
5mg α-淀粉酶溶于
反应柱 4ml蒸馏水，加入5mg石
—交联法
将酶包埋在细微网格或微囊里
——包埋法
固定化酶
◆优点
⑴既能与反应物接触，又能与产物分离 ⑵固定在载体上的酶还可以被反复 利用 ⑶稳定性好，便于运输和贮存。
填空：
固定化酶是将水溶性的酶用物理或 化学 的 方法固定在某种介质上，使之成为 不溶于水 而又有酶活性的制剂。可用 吸附 法将α-淀粉 酶固定在石英砂上形成固定化酶柱。
实验六
α-淀粉酶的固定化 及淀粉水解作用的检测
固定化酶
◆概念 将水溶性的酶用 物理 或 化学的方法固定
在某种介质上，使之成为 不溶于水 而又有 酶活性的制剂。
水溶性酶 水不溶性介质
固定化 水不溶性酶 （固定化酶）
◆固定化的方法
将酶吸附在介质表面
——吸附法
酶与介质通过共价键连接
——共价偶联法
将酶相互连接起来
固定化酶 英砂，搅拌30min。
将石英砂装入含气门
心并用夹子封住的注射器
气门心 夹子
中。用40ml蒸馏水用流速 1ml/min来洗涤 ，以除去
未吸附的游离淀粉酶 .
实验步骤
⒉α- 淀粉酶催化淀粉 分解成糊精。
使淀粉溶液以0.3 ml/min的流速过柱， 在流出5ml后接收 0.5ml流出液。加入 1-2滴 KI-I2 溶液 ， 观察颜色变化。

六、实验步骤
5mg α-淀粉酶+4mL蒸馏水 +5g石英砂（搅拌30min）
装入下端接有气门心并 用夹子封住的注射器中 10倍体积蒸馏水洗涤注射器以除去 未吸附的淀粉酶，流速1mL/min 用滴管滴加淀粉溶液，以 0.3mL/min流速过柱 为什么要控制流速？ 流出5mL溶液后接收0.5mL流出液，加 1~2滴过柱KI-I2溶液，观察颜色 10倍体积蒸馏水洗涤注射器4℃保存
一、基础知识 固定化酶：是将酶用物理或化学的方法 固定在某种介质上，使之成为不溶于水 而又有酶活性的制剂。 优点：固定化酶固定在一定的空间范围 内，可以重复使用，且能及时与产物分 离。
酶固定化的常用方法
吸附法
(1)物理吸附法 (基团与载体 共价结合。
交联法
酶蛋白的氨基以戊二醛 与载体相连。
四、实验材料 1、 α-淀粉酶，石英砂， 2、可溶性淀粉溶液 3、5mmol/LKI-I2溶液
五、实验原理
一定浓度的淀粉溶液经过固定酶柱后，
可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示剂溶液测
试，流出物呈红色，表明水解产物糊精生成。
淀粉
α-淀粉酶
糊精
β-淀粉酶
麦芽糖
糖化淀粉酶
葡萄糖
遇碘显 蓝色
遇碘显 红色
遇碘不 显色
七、实验结果
淀粉溶液
吸附有α-淀粉酶的石英砂
1
2
3
4
1、2mL水+1~2滴KI-I2溶液 2、2mL淀粉液+1~2滴KI-I2溶液 3、2mL淀粉滤液+1~2滴KI-I2溶液 4、2mL淀粉滤液+1~2滴KI-I2溶液+稀释1倍
八、问题讨论
1.如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀 粉酶？

《α-淀粉酶的固定化与淀粉水解作用的检测》实验方案第二实验班一组组长：张金昌组员：胡建军、朱恩梅、石仙竹、谢娟丽、李昀奕、郭天天2013．10.15α-淀粉酶的固定化与淀粉水解作用的检测一、实验背景资料：1、酶：活细胞产生的具有催化作用的有机物，其中绝大多数酶是蛋白质；具有高效性、专一性，同时，也有高度不稳定性，因为绝大多数酶的本质是蛋白质，凡是能使蛋白质变性的因素，如高温、高压、强酸、强碱等都会使酶丧失活性。

2、酶促反应：指由酶作为催化剂进行催化的化学反应；3、α-淀粉酶：为枯草杆菌的α-淀粉酶，其作用的最适PH为5.5~7.5，最适温度为50~70℃。

广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。

此酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖；在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。

4、固定化酶：借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定的空间内并仍具有催化活性的酶制剂。

酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化。

吸附法是酶分子吸附于水不溶性的载体上，它的优点是操作简便，条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可以反复使用。

5、吸附剂：常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

活性炭：活性炭是一种多孔性的含炭物质, 它具有高度发达的孔隙构造, 是一种极优良的吸附剂, 每克活性炭的吸附面积更相当于八个网球埸之多. 而其吸附作用是藉由物理性吸附力与化学性吸附力达成. 其組成物质除了炭元素外，尚含有少量的氢、氮、氧及灰份，其結构则为炭形成六环物堆积而成。

由于六环炭的不规则排列，造成了活性炭多微孔体积及高表面积的特性。

硅胶：硅胶是由硅酸凝胶mSiO2·nH2O适当脱水而成的颗粒大小不同的多孔物质。

具有开放的多孔结构，比表面（单位质量的表面积）很大，能吸附许多物质，是一种很好的干燥剂、吸附剂和催化剂载体。

除去未吸附的 游离淀粉酶
3、5mmol/L KI-I2溶液：称取0.127g碘和0.83g碘化钾。加 蒸馏水100ml完全溶解后装入滴瓶中。Biblioteka 蒸馏水5ml注射器
反应柱 固定化酶
气门心 夹子
实验步骤:
1、将灌注了固定化酶的 注射器放在注射器架上， 用滴管滴加淀粉溶液， 使淀粉溶液以0.3ml/min 的流速过柱。
可在试管中加入1ml可溶性淀粉，再加几滴淀粉酶柱 流出液，保温几分钟后用碘液检验。如仍显蓝色，则 流出液中没有淀粉酶了。 2、耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途? 可以在高温下使淀粉水解快，而且酶不会因高温上 而失活，所以可在一些需要高温加热同时又要水解 淀粉的反应中使用。
练习
1、研究认为，用固定化酶技术处理污 染物是很有前途的。如将从大肠杆菌得 到的磷酸三酯酶固定到尼龙膜上制成制 剂，可以用来降解残留在土壤中的有机 磷农药，与用微生物降解相比，其作用 不需要适宜的（ D ） A、温度 B、PH C、水分 D、营养
淀粉
α-淀粉酶
糊精
B—淀粉酶 麦芽糖糖化淀粉酶 葡萄糖
遇碘显蓝色
遇碘显红色
遇碘不显色
这里使用的是枯草杆菌的a-淀粉酶，其作用的最适温度为
50~75℃；最适PH为5.5~7.5
设备及用品：5ml塑料注射器
用气门心及夹子
50ml烧杯 滴管 自行车 注射器架 试管及微量离心管3支
实验材料:
1、a-淀粉酶的固定化：在烧杯中将5mg a-淀粉酶溶于 4ml蒸馏水中。由于酶不纯，可能有些不溶物。再加入 5g石英砂，不时搅拌，30min后装入1支下端接有气门 心并用夹子封住的注射器中(石英砂体积约4ml)。用10倍 体积的蒸馏水洗涤此注射器，流速为1ml/min。 2、可溶性淀粉溶液：取50ml可溶性淀粉溶于100ml热水 中，搅拌均匀。