pet28a 多克隆位点序列

宁波大学2016年攻读硕士学位研究生入学考试试题(A 卷)(答案必须写在答题纸上)考试科目:分子生物学科目代码：941适用专业:海洋生物学、生物化学与分子生物学第1页共1页一、名词解释（40分，每个4分）NCBI 、mutiple cloning site 、nested-PCR 、genetic central dogma 、RNA splicing 、intron 、gene family 、trans-acting factor 、Klenow fragment 、microsatellite DNA二、问答题（50分）1、简述原核生物DNA 复制过程中需要哪些酶和蛋白的参与，各具有何作用？（10分）2、原核生物基因转录的终止子的种类及作用机制。

（10分）3、真核生物mRNA 与原核生物mRNA 的区别。

（10分）4、试比较原核生物和真核生物启动子结构的差别。

（10分）5、简述乳糖操纵子调节机制。

（10分）三、分析题（60分）1.简述RNA 提取方法，并描述如何确定提取RNA 的质量？（15分）2.简述SDS-PAGE 电泳和Western blot 检测流程？（15分）3.引物设计题：已知下列序列，请根据此序列下划线标示区设计上下游引物。

（10分）GAGGTTGTTCGAAGGATTGGAACCGGTATAAGGGCGTTAGACGGCG……TTCTACGACGTCGTCGT CTTCTTCTTCTTCTTCGTCTGAACAATAGTGGACGAACCACG4.现要求在大肠杆菌(Escherichia coli )BL21中表达A 基因。

（20分）1）选择pET28a 为原核表达载体，假定某基因A 的ORF 序列中包含下列限制性内切酶位点Bam H I 、Hind III 、Sac I 。

pET28a 的多克隆位点如下：请为基因A 原核表达选择合适的限制性内切酶位点。

2）请写出实现A 基因在大肠杆菌中表达的实验流程。

Rosetta系列的表达菌株可以提供T7 RNA聚合酶，它能表达PET系列载体上的外源基因。

pGEX系列载体上的外源基因不需要T7 RNA聚合酶，普通的大肠杆菌经IPTG诱导即可表达Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。

其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac 启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成蛋白标签：pGEX4T1载体基本信息出品公司: GE别名: pGEX-4T-1, pGEX4T1, pGEX 4T 1质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体表达水平: 高拷贝启动子: Tac克隆方法: 多克隆位点，限制性切酶载体大小: 4969 bp5' 测序引物及序列: pGEX5': GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG3' 测序引物及序列: pGEX3': CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG载体标签: N-GST载体抗性: Ampicillin 氨苄备注: 复制子是pMB1产品目录号: 27-4580-01稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 诱导表达病毒/非病毒: 非病毒pGEX4T1载体质粒图谱和多克隆位点信息原核生物DNA复制起始点，是DNA链上独特的具有起始DNA复制功能的碱基序列。

大肠杆菌的复制起点包括OriC和OriHThrombin 凝血酶pGEX4T1载体简介pGEX4T1载体序列LOCUS pGEX-4T-1 4969 bp DNA circular SYN DEFINITION pGEX-4T-1ACCESSIONKEYWORDSSOURCEORGANISM other sequences; artificial sequences; vectors. COMMENT This file is created by Vector NTI.biofeng./COMMENT VNTAUTHORNAME|biofeng.|FEATURES Location/Qualifierssource 1..4969/organism="pGEX-4T-1"/mol_type="other DNA"promoter 184..212/label="tac_promoter"misc_feature 224..246/label="M13_pUC_rev_primer"gene 258..977/label="GST (variant)"/gene="GST (variant)"CDS 258..977/label="ORF frame 3"/label="pGEX_3_primer"promoter 1307..1335/label="AmpR_promoter"gene 1377..2237/label="Ampicillin"/gene="Ampicillin"CDS 1377..2237/label="ORF frame 3"rep_origin 2392..3011/label="pBR322_origin"misc_feature 3309..4400/label="lacI"CDS 3441..4400/label="ORF frame 3"promoter 4449..4478/label="lac_promoter"misc_feature 4492..4514/label="M13_pUC_rev_primer" promoter 4513..4531/label="M13_reverse_primer" CDS 4523..81/label="ORF frame 2"misc_feature 4540..4695/label="lacZ_a"/label="M13_forward20_primer"misc_feature complement(4552..4574)/label="M13_pUC_fwd_primer"pGEX4T2载体基本信息出品公司: GE别名: pGEX-4T-2, pGEX4T2, pGEX 4T 2 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体表达水平: 高拷贝启动子: Tac克隆方法: 多克隆位点，限制性切酶载体大小: 4970 bp5' 测序引物及序列: pGEX5': GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG 3' 测序引物及序列: pGEX3': CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG 载体标签: N-GST载体抗性: Ampicillin 氨苄备注: 复制子是pMB1产品目录号: 27-4581-01稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 诱导表达病毒/非病毒: 非病毒pGEX4T2载体质粒图谱和多克隆位点信息pGEX4T2载体简介pGEX4T2载体序列LOCUS pGEX-4T-2 4970 bp DNA circular SYN DEFINITION pGEX-4T-2ACCESSIONKEYWORDSSOURCEORGANISM other sequences; artificial sequences; vectors. COMMENT This file is created by Vector NTI.biofeng./COMMENT VNTAUTHORNAME|biofeng.|FEATURES Location/Qualifiers/organism="pGEX-4T-2"/mol_type="other DNA"promoter 184..212/label="tac_promoter"misc_feature 224..246/label="M13_pUC_rev_primer" gene 258..978/label="GST (variant)"/gene="GST (variant)"CDS 258..974/label="ORF frame 3"misc_feature complement(1020..1042)/label="pGEX_3_primer"promoter 1308..1336/label="AmpR_promoter"gene 1378..2238/label="Ampicillin"/gene="Ampicillin"CDS 1378..2238/label="ORF frame 1"rep_origin 2393..3012/label="pBR322_origin"misc_feature 3310..4401/label="lacI"/label="ORF frame 1"promoter 4450..4479/label="lac_promoter"misc_feature 4493..4515/label="M13_pUC_rev_primer"promoter 4514..4532/label="M13_reverse_primer"CDS 4524..81/label="ORF frame 3"misc_feature 4541..4696/label="lacZ_a"promoter complement(4544..4560)/label="M13_forward20_primer" misc_feature complement(4553..4575)/label="M13_pUC_fwd_primer" pGEX4T3载体质粒图谱和多克隆位点信息pGEX4T3载体简介pGEX4T3载体序列LOCUS pGEX-4T-3 4968 bp DNA circular SYN DEFINITION pGEX-4T-3ACCESSIONKEYWORDSSOURCEORGANISM other sequences; artificial sequences; vectors. COMMENT This file is created by Vector NTI.biofeng./COMMENT VNTAUTHORNAME|biofeng.|FEATURES Location/Qualifierssource 1..4968/organism="pGEX-4T-3"/mol_type="other DNA"promoter 184..212/label="tac_promoter"misc_feature 224..246/label="M13_pUC_rev_primer" gene 258..976/label="GST (variant)"/gene="GST (variant)"CDS 258..980/label="ORF frame 3"misc_feature complement(1018..1040)/label="pGEX_3_primer"promoter 1306..1334/label="AmpR_promoter"gene 1376..2236/label="Ampicillin"/gene="Ampicillin"CDS 1376..2236/label="ORF frame 2"rep_origin 2391..3010/label="pBR322_origin"misc_feature 3308..4399/label="lacI"CDS 3440..4399/label="ORF frame 2"promoter 4448..4477/label="lac_promoter"misc_feature 4491..4513/label="M13_pUC_rev_primer"promoter 4512..4530/label="M13_reverse_primer"CDS 4522..81/label="ORF frame 1"misc_feature 4539..4694/label="lacZ_a"promoter complement(4542..4558)/label="M13_forward20_primer"misc_feature complement(4551..4573)/label="M13_pUC_fwd_primer"pGEX6P1载体基本信息出品公司: GE别名: pGEX-6P-1, pGEX6P1, pGEX 6P 1 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体表达水平: 高拷贝启动子: Tac克隆方法: 多克隆位点，限制性切酶载体大小: 4984 bp5' 测序引物及序列: pGEX5': GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG 3' 测序引物及序列: pGEX3': CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG 载体标签: N-GST载体抗性: Ampicillin 氨苄备注: 复制子是pMB1产品目录号: 27-4597-01稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 诱导表达病毒/非病毒: 非病毒pGEX6P1载体质粒图谱和多克隆位点信息pGEX6P1载体简介pGEX6P1载体序列LOCUS pGEX-6P-1 4984 bp DNA circular SYN DEFINITION pGEX-6P-1ACCESSIONKEYWORDSSOURCEORGANISM other sequences; artificial sequences; vectors. COMMENT This file is created by Vector NTI.biofeng./COMMENT VNTAUTHORNAME|biofeng.|FEATURES Location/Qualifierssource 1..4984/organism="pGEX-6P-1"/mol_type="other DNA"promoter 184..212/label="tac_promoter"misc_feature 224..246/label="M13_pUC_rev_primer"gene 258..992/label="GST"/gene="GST"CDS 258..992/label="ORF frame 3"misc_feature 918..938/label="precision"misc_feature complement(1034..1056)/label="pGEX_3_primer"promoter 1322..1350/label="AmpR_promoter"gene 1392..2252/label="Ampicillin"/gene="Ampicillin"CDS 1392..2252/label="ORF frame 3"rep_origin 2407..3026/label="pBR322_origin"misc_feature 3324..4415/label="lacI"CDS 3456..4415/label="ORF frame 3"promoter 4464..4493/label="lac_promoter"misc_feature 4507..4529/label="M13_pUC_rev_primer"promoter 4528..4546/label="M13_reverse_primer"CDS 4538..81/label="ORF frame 2"misc_feature 4555..4710/label="lacZ_a"promoter complement(4558..4574)/label="M13_forward20_primer" misc_feature complement(4567..4589)/label="M13_pUC_fwd_primer"pET28a载体基本信息出品公司: EMD Biosciences (Novagen)别名: pET28a, pet 28a, pET-28a(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性切酶载体大小: 5369 bp5' 测序引物及序列: T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' 载体标签: N-His, N-Thrombin, N-T7, C-His载体抗性: 卡那备注: N端含有Thrombin蛋白酶切位点; pET28a, b, c 的差异仅仅存在于多克隆位点处。

某理工大学生物工程学院《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 根据A基因序列设计原核表达引物。

A基因序列如下：ATGTCCGAAGTAATCGAAGAACATCTTCTCAGCGATAATTCTGATGATTCCAGCTCGGAAT TGACTTCTAC………GGACGAACCACGAAGAGACGATATTAApET28a多克隆位点如下引物设计必须满足：要求在引物两端分别加上BamHI（GGATCC）和EcoRI（GAATTC）。

要求表达的重组蛋白C端带His标签。

答案：设计聚合酶时应注意：（1）酶切位点前后应添加1～6个保护碱基，以提高限制性核酸内切酶的切割效率。

（2）His标签位于酶切位点的下游，且靠近终止密码子，且mRNA的翻译方向是由N端向C端，所以目的片段插入时花絮的顺序不颠倒。

（3）引物长度一般在18～27bp，且与目的片段有合适的互补长度以保证引物可以顺利结合。

上游引物可为（5′端至3′端）：CGCGGATCCGCGATGTCCGAAGTA。

下游引物可为（5′端至3′端）：GGCCTTAAGGCCAATTATAGCAGA。

解析：2、判断题（55分，每题5分）1. 增强子通过结合某些蛋白质因子，改变染色质DNA的结构而促进转录。

（）答案：正确解析：增强子是DNA上一小段段可与蛋白质联结的区域，与蛋白质联结之后，基因的转录作用将会加强。

2. 多数情况下，外显子是编码氨基酸的基因序列。

（）[扬州大学2019研]答案：正确解析：在RNA剪接过程中，被称为内含子的即非编码区从mRNA脂类分子中被切除，基因中被称为外显子的编码区拼接已经形成成熟mRNA。

3. SPO1是枯草杆菌的噬菌体，它通过对RNA polσ因子的更换实现其早、中、晚基因表达的时序控制，这和T7噬菌体的表达方式非常类似。

河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 根据A基因序列设计原核表达引物。

A基因序列如下：ATGTCCGAAGTAATCGAAGAACATCTTCTCAGCGATAATTCTGATGATTCCAGCTCGGAAT TGACTTCTAC………GGACGAACCACGAAGAGACGATATTAApET28a多克隆位点如下引物设计必须满足：要求在引物两端分别加上BamHI（GGATCC）和EcoRI（GAATTC）。

要求表达的重组蛋白C端带His标签。

答案：设计甲基化时应注意：（1）酶切位点前后应添加1～6个保护碱基，以提高限制性核酸内切酶的切割效率。

（2）His标签位处酶切位点的下游，且靠近终止密码子，且mRNA的翻译方向是由N端向C端，所以目的片段插入时的顺序不（3）引物长度一般在18～27bp，且与目的片段有合适可行的互补长度以保证引物可以顺利结合。

上游引物可为（5′端至3′端）：CGCGGATCCGCGATGTCCGAAGTA。

下游引物可为（5′端至3′端）：GGCCTTAAGGCCAATTATAGCAGA。

解析：2、判断题（55分，每题5分）1. 在所有原核与真核生物中，AUG都是唯一的翻译起始密码子。

（）答案：错误解析：在所有真核绝大多数生物与大多数原核生物中，AUG是翻译的若某密码子。

少数细菌（属于原核生物）以GUG（缬氨酸）或UUG 为起始密码子。

线粒体和叶绿体使用的遗传密码略为有差异，如线粒体和细胞器以AUG、AUU、AUA为起始密码子。

2. 线粒体DNA的编码方式与通用密码子不同，有些密码的编码氨基酸和编码性质不同。

（）答案：正确3. 表观遗传效应是不可遗传的。

河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 根据A基因序列设计原核表达引物。

A基因序列如下：ATGTCCGAAGTAATCGAAGAACATCTTCTCAGCGATAATTCTGATGATTCCAGCTCGGAAT TGACTTCTAC………GGACGAACCACGAAGAGACGATATTAApET28a多克隆位点如下引物设计必须满足：要求在引物两端分别加上BamHI（GGATCC）和EcoRI（GAATTC）。

要求表达的重组蛋白C端带His标签。

答案：设计引物时应注意：（1）酶切位点前后应添加1～6个保护碱基，以提高限制性核酸内切酶的切割效率。

（2）His标签坐落于酶切位点的下游，且靠近终止密码子，且mRNA的翻译方向是由N端向C端，所以目的短片插入时的顺序不颠倒。

（3）引物长度一般在18～27bp，且与目的片段有合适的互补长度以保证互补肽键可以顺利结合。

上游引物可为（5′端至3′端）：CGCGGATCCGCGATGTCCGAAGTA。

下游引物可为（5′端至3′端）：GGCCTTAAGGCCAATTATAGCAGA。

解析：2、判断题（55分，每题5分）1. 若双链DNA中的一条链碱基顺序为pCpTpGpGpApC，则另一条链的碱基顺序为pGpApCpCpTpG。

（）答案：错误解析：因为DNA单链书写时是5′端在前，而DNA双螺旋中的两条链是反向互补平行，因此若双链DNA中的一条链碱基分组为pCpTpGpGpApC，则另一条链的碱基顺序为pGpTpCpCpApG。

2. 尼龙膜是核酸杂交的一种固体支持物，具有同DNA结合能力强韧性强，可反复洗脱运用，并且杂交信号本底低。

（）答案：错误解析：尼龙莱菲县膜是核酸杂交的一种固体支持物，有同DNA结合能力强、韧性强，可反复洗脱使用，并且杂交信号本底低等优点，但是成本高。

pET-28b（+）载体（基本信息、图谱和多克隆位点信息、简介、序列）1.pET28a载体基本信息：质粒类型：大肠杆菌表达载体表达水平：高克隆方法：多克隆位点，限制性内切酶载体大小：5368bp5' 测序引物及序列: T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'3' 测序引物序列: T7t: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'载体标签: N-His, N-Thrombin, N-T7, C-His载体抗性：Kanamycin (卡那霉素)N端含有凝血酶（Thrombin）蛋白酶位切点；pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处病毒类型：非病毒2.pET28a载体质粒图谱和多克隆位点信息：3.pET28a载体简介pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时含有一个可以选择的C端His标签。

pET28a载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。

注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。

T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。

质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. No. 69337-3)的作用下终止蛋白翻译。

3.pET28a载体简介pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时N端含有凝血酶（Thrombin）蛋白酶位切点；pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处载体描述：The pET-28a-c(+) vectors carry an N-terminal His•Tag®/ thrombin/ T7•Tag® configuration plus an optional C-terminal His•Tag sequence. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymeraseis shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containingsingle-stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single stranded sequencing should be performed using the T7 terminator primer (Cat. No. 69337-3).PET-28a-c(+) 向量进行 N-末端His•Tag® / 凝血酶/ T7•Tag® 配置再加上可选的 C-末端His•Tag 序列。

某理工大学《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 根据A基因序列设计原核表达引物。

A基因序列如下：ATGTCCGAAGTAATCGAAGAACATCTTCTCAGCGATAATTCTGATGATTCCAGCTCGGAAT TGACTTCTAC………GGACGAACCACGAAGAGACGATATTAApET28a多克隆位点如下引物设计必须满足：要求在引物两端分别加上BamHI（GGATCC）和EcoRI（GAATTC）。

要求表达的重组蛋白C端带His标签。

答案：设计引物时应注意：（1）酶切位点前后应添加1～6个保护碱基，以提高限制性核酸内切酶的切割效率。

（2）His标签位于酶切位点的下游，且靠近终止密码子，且mRNA的翻译方向是由N端向C端，所以目的片段插入时的顺序不颠倒。

（3）引物长度一般在18～27bp，且与目的片段有合适的互补长度以保证引物可以顺利结合。

上游引物可为（5′端至3′端）：CGCGGATCCGCGATGTCCGAAGTA。

下游引物可为（5′端至3′端）：GGCCTTAAGGCCAATTATAGCAGA。

解析：2、判断题（80分，每题5分）1. 乳糖操纵子存在负控诱导系统和正控诱导系统的调控机制。

（）[扬州大学2019研]答案：正确解析：乳糖操纵子存在负控诱导系统和正控诱导系统的调控机制，分别是阻遏蛋白的负性调节和CAP的正性调节。

2. 组蛋白基因、rRNA基因和tRNA基因等都属于串联重复基因，它们的产物都是细胞所大量需要的。

（）答案：正确解析：串联重复基因的特点如下：①各成员之间有高度的序列一致性，甚至完全相同；②拷贝数高，常有十几个甚至几百个；③非转录的间隔区短而一致。

组蛋白基因、rRNA基因和tRNA基因等都属于串联重复基因，它们的产物都是细胞所大量需要的。

碱裂解法提取表达质粒载体pET-28a及电泳鉴定1. 实验原理可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子叫载体（vector）。

细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。

与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。

大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。

一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单一位点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。

常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。

为表达蛋白质设计的载体称为表达载体(expression vector)。

pET系统是有史以来在大肠杆菌中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统之一，有一系列类似的表达载体。

如表达载体pET28a(见图3)，含有：T7噬菌体启动子、核糖体结合位点、乳糖操纵子、乳糖阻遏子序列（lacI）、 His6标签序列、凝血酶切割位点、多克隆位点、T7噬菌体终止子及pBR322复制子、f1噬菌体复制子、卡那霉素筛选标记序列等。

pET表达系统中的受体菌为能够产生T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)。

碱变性法抽提质粒DNA主要包括收集并悬浮细菌菌体、裂解细胞、将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA以纯化质粒DNA。

我们购买的质粒提取试剂盒的原理也是碱解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。