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兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养体会骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨进行性退变病变慢性疾病，近些年发病率在不断增高。
基础研究主要有各种原因引起的细胞数量过少而无法开展下去。
在建立动物模型的基础上更有效的提取软骨细胞、体外培养对基础研究做出最基本铺垫，为临床治疗提供更有效的理论依据。
本文通过软骨的提取、软骨的消化、细胞的收集、培养、鉴定，结合国内外文献做一综述。
标签：骨关节炎；软骨细胞；体外培养软骨组织﹙cartilage）由软骨细胞﹙chondrocyte）和细胞外基质﹙extracellularmatrix，ECM﹚构成，软骨细胞是关节软骨主要构成成分，主要功能是合成、分泌软骨基质，维持软骨组织新陈代谢，是软骨破坏过程中的靶细胞，因此软骨细胞的体外培养是研究关节软骨生理及病理的常用体外实验模型，尤其是骨关节炎软骨细胞的提取在研究治疗骨关节炎、最基本最关键的一步[1]。
自从1967年Manning[2]采用胰蛋白酶和细菌胶原酶联合消化法获得了高纯度的软骨细胞以来，为了获得数量较多的软骨细胞，软骨细胞的提取、培养、传代、鉴定，等不断改进。
但不同的动物，不同的模型对软骨细胞的提取也有一定的不同。
本文通过对兔膝骨关节炎造模成功后提取软骨细胞进行培养、传代、鉴定进一步认识兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养的要点及关键问题等。
1软骨的提取将实验兔用空气栓塞法处死，沿右膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出以膝关节为中心约6 cm×6 cm的区域，浸泡于75%的酒精中20～30 min，放入超净台中打开膝关节腔，无菌条件下用11号刀片（带柄）削取膝關节股骨髁和胫骨平台软骨组织，将获得关节软骨组织，置入盛有含青霉素钠/链霉素双抗液（1×1010U/L）的D-hanks液的无菌平皿中，用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks 液10 mL漂洗3遍，用眼科剪将软骨组织剪成1mm3小块，见图1，然后再用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks液10 mL漂洗3遍。
一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法我折腾了好久原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，总算找到点门道。
一开始的时候，我真是瞎摸索，完全是在黑暗中前行。
我先说说取材这步吧。
从小鼠或者大鼠身上取软骨，这可真不是个容易事儿。
我一开始的时候啊，手法特别不熟练。
你想啊，找到准确的软骨部位就像在一堆电线里找到那根特殊颜色的线一样难。
有一次我不小心把周围的组织也切了不少，结果肯定是不理想的。
后来我就看了很多解剖的图，还专门找会的人请教了几次。
这才慢慢熟悉起来。
就是要很小心地沿着关节切，尽量只取到软骨组织。
取得软骨组织后就是消化了。
我试过好几种酶，像胰蛋白酶还有胶原酶什么的。
胰蛋白酶消化的时候，我发现时间特别难控制。
有一回消化时间长了一点，细胞都损伤了不少。
后来我就慢慢试，就像做饭试调料一样，一点一点找感觉。
胶原酶相对来说要温和一些，但也要注意浓度。
合适的浓度就像是刚好能开锁的钥匙，太浓或者太淡都不行。
分离完细胞下一步就是培养了。
培养条件真的是需要精心调整。
我在培养瓶的选择上也纠结了挺久。
普通的培养瓶感觉细胞的贴壁不是很理想。
后来换了那种专门对细胞贴壁有帮助的培养瓶，情况才好一些。
还有培养液，它得包含细胞生长需要的所有营养成分啊，像氨基酸、糖、维生素这些，那都是细胞的食物呢。
我一开始没把温度和二氧化碳浓度太当回事儿，结果细胞长得歪歪扭扭的。
后来严格把温度和二氧化碳浓度控制在合适的范围，细胞才比较茁壮地生长。
还有细胞每过一段时间就得看看它们的状态，就像看自己养的小宠物一样。
如果发现有污染了，那前面的努力可就白费了。
有一回就因为一点小小的疏忽，培养物被污染了，整个心血都付诸东流了，那个时候可沮丧了。
后来就很注意无菌操作，一切步骤都特别小心。
这培养原代软骨细胞啊，真的是个细致活儿，要不断尝试总结经验，每一个小的失误都可能导致失败。
我现在也不敢说就完全掌握了这方法，但好歹能有点成果出来。
我还想不断改进呢，也欢迎你有啥心得也跟我交流交流。
软骨细胞培养流程
《软骨细胞培养流程》
软骨细胞培养是一种重要的实验技术，用于研究软骨细胞的生长、增殖和分化。
软骨细胞是一种特殊的细胞，具有重要的支持和维持软骨组织结构和功能的作用。
软骨细胞培养流程需要一系列精细的操作和严格的实验条件。
首先，要获得软骨组织样品，可以从实验动物或人体骨骼中获取。
然后将软骨组织样品切割成小块，并用消化酶处理，以释放软骨细胞。
接下来，将释放的软骨细胞收集并进行离心，去除异物和细胞碎片。
然后将软骨细胞将种植到培养皿中，添加适当的细胞培养基，并将培养皿放入细胞培养箱中进行培养。
在细胞培养过程中，需要密切观察软骨细胞的生长状态，定期更换培养基，并进行细胞传代。
此外，还需要进行细胞鉴定、纯化和分化培养等步骤，以确保所培养的细胞具有良好的生长和分化能力。
软骨细胞培养流程需要严格控制细胞生长环境的温度、湿度、气体和营养物质等条件，以确保细胞的稳定生长和繁殖。
另外，在细胞培养过程中也需要注意防止细菌、真菌和病毒的污染，保持细胞培养环境的洁净和安全。
通过细胞培养技术，研究人员可以获取大量的软骨细胞用于进一步的实验研究，以深入了解软骨细胞的生物学特性和功能，为软骨组织工程和临床治疗提供重要的基础和支持。
自体软骨细胞体外培养用于法规的要求全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：自体软骨细胞是一种重要的细胞类型，具有重要的生物学功能和医学应用价值。
在现代医学领域中，利用自体软骨细胞进行体外培养已经成为一种常见的治疗手段，尤其在关节炎、软骨缺损修复等方面具有重要的临床应用前景。
为了确保自体软骨细胞的体外培养安全有效，必须遵守一系列的法规和规定。
一、生物安全规范在进行自体软骨细胞的体外培养过程中，首要保证的是生物安全。
需要遵守相关生物安全规范，确保实验室环境清洁、无菌，并采取必要的生物安全措施，避免污染和交叉感染的发生。
还需要对实验室设施进行定期检查和维护，确保实验环境符合生物安全要求。
二、细胞质量控制在进行自体软骨细胞的体外培养过程中，需要严格控制细胞的质量。
细胞来源必须合法合规，采集方式符合相关伦理规定，并确保细胞的纯度和活性。
在培养过程中，需要严格控制培养基的成分和质量，确保细胞在最适宜的环境中生长和分化。
三、质量管理体系为了确保自体软骨细胞的体外培养质量和安全，需要建立完善的质量管理体系。
这包括建立标准操作程序（SOP）、记录管理系统和质量控制流程，确保各项操作符合规范和标准。
还需要建立相关的质量标准和指标，对自体软骨细胞的培养过程进行全面监测和评估。
四、临床试验规范在进行自体软骨细胞的体外培养临床应用前，需要进行严格的临床试验。
这包括临床试验设计、试验伦理和数据分析等方面的规范，确保临床试验的结果可靠、科学和合法。
还需要遵守相关临床试验规定，如《临床试验管理办法》等，确保试验过程合规。
五、知识产权保护在利用自体软骨细胞进行体外培养时，必须遵守相关知识产权规定，保护相关技术和成果。
这包括专利申请、技术保密和合作协议等方面的保护措施，确保相关成果的合法性和可持续发展。
要保证自体软骨细胞的体外培养安全有效，必须严格遵守各项法规和规定，确保操作符合规范和标准。
只有在遵守相关法规的前提下，才能更好地保障自体软骨细胞的体外培养质量和安全，为其临床应用提供可靠保障。
摘要：本研究旨在通过体外培养软骨细胞，探讨软骨细胞的生长特性、增殖能力及其在生物医学领域的应用潜力。
通过一系列实验，我们对软骨细胞的体外培养条件、增殖状态、细胞形态及功能进行了深入研究。
以下为实验总结。
一、实验目的和要求：1. 建立软骨细胞体外培养体系，优化培养条件。
2. 观察软骨细胞的增殖状态、细胞形态变化及功能表达。
3. 探讨软骨细胞在生物医学领域的应用前景。
二、实验仪器设备：1. 培养箱2. 超净工作台3. 移液器4. 倒置显微镜5. CO2培养箱6. 电热恒温水浴锅7. 流式细胞仪8. 低温离心机9. 低温冰箱三、实验设计及调试：（一）实验内容：1. 软骨细胞分离与培养2. 软骨细胞增殖实验3. 软骨细胞形态观察4. 软骨细胞功能实验（二）实验电路：无（三）实验设计及调试步骤：1. 对实验内容和实验电路进行分析，理出完成实验的设计思路。
2. 列出程序设计所需的特殊标志位、堆栈sp、内部ram、工作寄存器等资源的分配列表，分配列表时注意考虑资源在程序执行过程可能会出现冲突的问题。
3. 画出程序设计流程图，包括主程序和各子程序流程图。
4. 根据上述内容写出实验程序。
5. 调试程序，使用模拟仿真器进行模拟实验，观察结果，修改程序，继续调试，直至实验成功。
（四）实验调试过程中所遇到的问题、解决问题的思路和方法：1. 问题：软骨细胞在培养过程中出现污染。
解决方法：加强无菌操作，提高实验室空气质量，定期更换培养箱内的空气。
2. 问题：软骨细胞增殖缓慢。
解决方法：优化培养条件，调整细胞密度，增加生长因子。
3. 问题：软骨细胞功能表达不足。
解决方法：延长培养时间，提高细胞浓度，优化培养条件。
四、实验结果与分析：1. 软骨细胞在体外培养条件下，成功分离并建立了稳定的细胞系。
2. 软骨细胞增殖实验结果显示，细胞在体外培养条件下具有较好的增殖能力。
3. 软骨细胞形态观察表明，细胞呈典型的软骨细胞形态，细胞质丰富，细胞核清晰。
一、实验背景软骨钙化是软骨退行性疾病中常见的病理变化，是导致关节疼痛、功能障碍的重要原因。
近年来，随着对软骨钙化研究的深入，发现软骨细胞在钙化过程中起着关键作用。
本研究旨在通过体外实验，观察软骨细胞钙化过程，探讨软骨细胞钙化的影响因素。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）细胞：购自国内某生物技术公司的大鼠原代软骨细胞。
（2）试剂：细胞培养基、胎牛血清、钙离子、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、胰蛋白酶、EDTA、硝酸铝、碳酸钙等。
2. 实验方法（1）细胞培养：将大鼠原代软骨细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
（2）软骨细胞钙化诱导：在细胞培养第3天，加入一定浓度的钙离子，模拟体内钙化环境。
（3）钙化程度观察：分别在钙化诱导后第1、3、5、7天，取细胞爬片，用硝酸铝溶液染色，显微镜下观察钙化程度。
（4）钙化相关基因表达检测：采用实时荧光定量PCR技术检测钙化相关基因（如碱性磷酸酶、钙结合蛋白等）的表达。
（5）钙化相关蛋白表达检测：采用Western blot技术检测钙化相关蛋白（如碱性磷酸酶、钙结合蛋白等）的表达。
三、实验结果1. 钙化程度观察显微镜下观察发现，随着钙化诱导时间的延长，细胞逐渐出现钙化现象，钙化程度逐渐加深。
第1天钙化程度较轻，细胞周围出现少量钙化结节；第3天钙化程度有所加重，细胞周围出现较多钙化结节；第5天钙化程度明显加重，细胞周围钙化结节增多；第7天钙化程度达到最高，细胞周围钙化结节密集。
2. 钙化相关基因表达检测实时荧光定量PCR结果显示，随着钙化诱导时间的延长，碱性磷酸酶、钙结合蛋白等钙化相关基因的表达水平逐渐升高，提示钙化相关基因在软骨细胞钙化过程中发挥重要作用。
3. 钙化相关蛋白表达检测Western blot结果显示，随着钙化诱导时间的延长，碱性磷酸酶、钙结合蛋白等钙化相关蛋白的表达水平逐渐升高，与钙化相关基因表达趋势一致。
四、讨论本研究通过体外实验，成功诱导了软骨细胞钙化，并观察到随着钙化诱导时间的延长，细胞钙化程度逐渐加深，钙化相关基因和蛋白表达水平逐渐升高。
一、实验目的本次实验旨在了解和掌握人体软骨的生物学特性，通过体外培养技术，观察软骨细胞的生长、增殖、形态变化以及分泌功能，为进一步研究软骨组织的再生和修复提供实验基础。
二、实验材料与仪器1. 材料：- 人体软骨组织样本- DMEM培养基- 胎牛血清- 胶原酶- 细胞培养板- CO2培养箱- 显微镜2. 仪器：- 高速离心机- 离心管- 移液器- 电子天平三、实验方法1. 软骨组织样本处理：- 取新鲜的人体软骨组织样本，用生理盐水清洗后，剪成1mm×1mm×1mm大小的组织块。
- 将组织块用胶原酶消化，消化时间为30分钟，期间每隔5分钟搅拌一次。
- 消化结束后，将消化液以1000 r/min离心5分钟，弃去上清液，沉淀物用DMEM培养基重悬。
2. 软骨细胞培养：- 将重悬后的细胞悬液接种于细胞培养板，每孔1ml。
- 将细胞培养板放入CO2培养箱，培养温度为37℃，CO2浓度为5%，培养24小时后更换新鲜培养基。
- 每隔3天更换一次培养基，观察细胞生长情况。
3. 细胞形态观察：- 使用显微镜观察细胞形态变化，包括细胞增殖、细胞集落形成等。
4. 细胞功能检测：- 通过检测细胞培养液中硫酸软骨素（CS）的含量，了解软骨细胞的分泌功能。
四、实验结果1. 细胞形态观察：- 培养第3天，细胞开始贴壁生长，呈圆形或椭圆形。
- 培养第7天，细胞逐渐融合成集落，细胞形态开始分化，部分细胞呈长梭形。
2. 细胞增殖：- 细胞接种后第3天，细胞数量开始增加，第7天细胞数量达到最高峰，之后细胞增殖速度逐渐减慢。
3. 细胞功能检测：- 培养第7天，细胞培养液中CS含量为（2.5±0.3）mg/L，表明软骨细胞具有一定的分泌功能。
五、实验讨论1. 体外培养的人体软骨细胞能够生长、增殖，并具有一定的分化能力，说明软骨细胞具有再生和修复的潜力。
2. 细胞培养过程中，细胞增殖速度逐渐减慢，可能与细胞接触抑制有关。
巨噬细胞与软骨细胞共培养
巨噬细胞是一种免疫系统中的主要细胞类型，主要功能是吞噬和
消化体内的病原体或异物。
而软骨细胞是一种特殊的结缔组织细胞，
主要存在于软骨组织中，起到维护和修复软骨组织的功能。
巨噬细胞与软骨细胞共培养可以模拟一些炎症和损伤等生理或病
理过程。
在共培养中，巨噬细胞可以受到刺激，产生一系列的炎症因子，包括细胞因子和趋化因子，这些因子可以通过细胞间相互作用传
递到软骨细胞，对软骨细胞的生理状态和功能产生影响。
研究已经显示，巨噬细胞激活可以导致软骨细胞的炎症反应和损伤，同时也可以激活软骨细胞的修复和再生机制。
此外，巨噬细胞还
可以影响软骨细胞的分化和增殖，并调节软骨组织的胶原合成和分解。
通过巨噬细胞与软骨细胞共培养，可以更好地理解巨噬细胞和软
骨细胞之间的相互作用及其在炎症和修复过程中的作用机制，有助于
深入了解相关疾病的发病机制，并为开发相关治疗策略提供理论依据。
软骨细胞培养及其调控(一)关键词：软骨细胞自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来〔1〕，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。
实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨〔2〕。
虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。
软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。
软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。
在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。
组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。
1细胞因子对体外培养软骨细胞的影响软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。
近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。
也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。
目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下：1.1转化生长因子beta(TGF-β)TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。
中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第41期 2010–10–08出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research October 8, 2010 Vol.14, No.41ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH7713软组织工程研究：软骨细胞的培养《中国组织工程研究与临床康复》杂志社学术部，辽宁省沈阳市 1100040 引言软骨由软骨细胞和软骨基质构成。
软骨创伤后的修复甚为困难，因为软骨细胞属于增殖能力极弱的终末分化细胞，缺乏再生能力。
软骨组织受损后，其周围正常软骨细胞不能迅速增殖，产生新的基质来修复。
但经体外消化获得的软骨细胞却能够在体外合适的环境或载体中分裂、增殖，分泌细胞外基质。
对于软骨缺损，以往大多数研究倾向于用含未分化间充质细胞的骨膜、软骨膜或直接细胞移植修复。
直接细胞移植由于细胞堆积在一起，缺乏营养和气体交换，无法进行分裂、增殖、合成基质，最终难于形成软骨组织。
而生物相容性良好和生物可降解性细胞载体的应用，能为软骨细胞提供理想的表面支持和稳定的三维空间支架结构，以及足够的孔隙率，供细胞在其中进行物质交换、生长代谢和分泌软骨基质。
以三维立体培养为基础的组织工程技术在软骨细胞培养方面已取得突破性进展。
用软组织工程技术构建软骨的重要条件之一就是获得一定数量的软骨细胞，体外培养、扩增并保持一定的功能活性。
1 软骨细胞外基质软骨细胞外基质由胶原和蛋白聚糖组成，其中胶原占软骨干重的50%~70%，蛋白聚糖占20%~40%，结构糖蛋白占有5%~15%。
胶原主要由Ⅱ型组成，其他还含有少量的Ⅴ型、Ⅵ型、Ⅸ型、Ⅹ型和Ⅺ型胶原，它们形成一个网络结构，使软骨具有特殊的应力和形态，对抗高度新水的蛋白聚糖产生的肿胀压。
在纤维软骨和弹性软骨中，Ⅰ型胶原也是其主要的组成部分之一。
Ⅱ型胶原是软骨的主要胶原，主要由软骨细胞分泌，在透明软骨中占软骨总胶原的85%~90%，提供了软骨特有的张力和硬度，是软骨特异性分子及软骨细胞分化的特征。
软骨细胞培养及其调控【摘要】本文介绍了软骨细胞培养及其调控的相关内容。
在阐述了软骨细胞培养及其调控的概述以及软骨细胞在人体中的重要性。
在分别探讨了软骨细胞培养技术、生长因子对软骨细胞生长的调控、细胞外基质对软骨细胞的影响、生物力学调控软骨细胞功能以及调控软骨细胞分化的方法。
在展望了软骨细胞培养及其调控的前景，并指出了研究中存在的问题与挑战。
通过本文的介绍，读者可以了解软骨细胞的培养和调控在组织工程和再生医学领域的重要作用，同时也能够认识到未来研究中需要解决的挑战。
【关键词】软骨细胞培养, 软骨细胞调控, 生长因子, 细胞外基质, 生物力学, 分化, 前景, 问题, 挑战1. 引言1.1 软骨细胞培养及其调控概述软骨细胞培养是一种重要的细胞培养技术，可以为软骨修复和再生提供重要的支持。
软骨细胞的培养与调控是软骨组织工程的关键步骤，通过控制培养条件和添加合适的生长因子等方法，可以促进软骨细胞的增殖和分化，从而实现软骨组织的修复和再生。
软骨组织是人体内一种重要的结缔组织，具有耐压、弹性好等特点，因此软骨细胞的培养与调控对于维持软骨组织的功能和结构至关重要。
在软骨细胞培养及其调控的研究中，已经取得了一些进展，但同时也存在一些挑战和问题，需要进一步深入研究。
软骨细胞培养及其调控的研究对于促进软骨组织工程的发展，提高软骨修复和再生的效果具有重要意义。
1.2 软骨细胞的重要性软骨细胞是软骨组织的主要细胞类型，具有重要的生理功能和临床意义。
在人体中，软骨细胞通过合成和分泌胶原蛋白、硫酸软骨素等细胞外基质成分，维持着软骨组织的结构和功能。
软骨组织具有良好的弹性和韧性，能够减轻关节间的摩擦和冲击，保护关节软骨不受损伤。
软骨细胞还参与修复和再生过程，对于损伤软骨的修复至关重要。
在生理情况下，软骨细胞的增殖和分化受到多种生长因子、细胞外基质成分和生物力学信号的调控。
这些调控因素对软骨细胞的生长、合成和分泌具有重要影响，是软骨组织正常功能的保障。
软骨细胞工程在关节疾病治疗中的应用随着人们生活水平的提高和医学技术的不断进步，越来越多的关节疾病得到了有效的治疗。
软骨细胞工程作为一种新型的治疗方式，已经在关节疾病治疗中得到广泛应用。
本文将详细介绍软骨细胞工程在关节疾病治疗中的应用，包括其原理、技术、研究进展等方面。
一、软骨细胞工程的原理软骨细胞工程是利用体外培养大量的软骨细胞，并在适当的载体中进行种植，最终重建或修复软骨组织的一种方法。
其原理基于软骨组织的生物学和医学原理，并通过体外培养软骨细胞及载体的种植来达到治疗目的。
软骨细胞工程基本分为三个步骤：首先，从患者身体中取出一定量的软骨细胞；其次，将这些细胞进行体外培养，大量繁殖；最后，将培养好的软骨细胞种植到适当的载体中，进行生长、修复或再现。
二、软骨细胞工程在关节疾病治疗中的技术软骨细胞工程需要特定的技术，为了成功地进行这项治疗，需要有熟练的技能和专业的知识。
软骨细胞工程中涉及的技术主要包括：（1）软骨组织损伤的定位与检查。
软骨细胞工程是基于软骨组织的生长和修复原理，因此需要先确定组织损伤的范围、深度和程度。
在定位后，通过检查来判断软骨组织提取或种植的适宜条件。
（2）软骨细胞的提取及体外培养。
从患者身体中提取一定量的软骨细胞，是进行软骨细胞工程的外科手术步骤。
材料的取样量、位置和方法需要特别注意，以避免对患者造成额外的伤害。
提取出来的软骨细胞，通过体外培养技术，大量繁殖和增生，为后续的种植做好准备。
（3）种植载体的选择与设计。
软骨细胞种植载体的选择及设计是软骨细胞工程中非常关键的环节。
Carrier是发挥作用相对较短，一般为3-4周，用于维持ITO和JGO珊瑚离体组织在生长和再生闭环中的生存和成长。
合适的Carrier能够保证软骨细胞的正常生长和修复，最终实现治疗目标。
（4）软骨细胞种植的技术。
种植的过程非常细致、精确，需要用到各种微小、精密的工具和技术。
软骨细胞的种植应避免空气接触，种植面要保持干燥，以降低感染的发生率。
软骨细胞培养(1)豚鼠脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。
(2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节（保留周围肌肉，软骨不能暴露），75%酒精浸泡5分钟，转移至PBS缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软组织，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软骨组织，置入装有PBS缓冲液的无菌培养皿，防止软骨组织被风干。
(3)PBS缓冲液充分漂洗软骨小块3次，然后用小剪刀将软骨块切碎至约lmm3大小。
(4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软骨块置入放有0.2%的Ⅱ型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37℃恒温震荡箱中消化，40分钟后将上层消化液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min，收集细胞（沉淀物），加入含10%的胎牛血清DMEM培养液4ml并吹打混匀，制成软骨细胞混悬液。
(5)把消化所得的软骨细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数，并把细胞混悬液密度调整为2×105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。
将培养瓶放置于CO2培养箱内。
培养条件为37℃、5%CO2。
(6)未消化完的软骨小块继续用Ⅱ型胶原酶如上法消化，直至软骨块基本消失。
(7)每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况并拍照保存。
药物制备龟甲胶、鹿角胶各10克，氨基葡萄糖1.5克，分别加PBS缓冲液30ml配成10g/30ml、10g/30ml和1.5g/30ml的溶液。
然后分别取上述溶液各0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml放于不同的15ml离心管中，加PBS定容至10ml，各配成6管分别为2.5%、5%、10%、20%、30%、40%含药的PBS，放4℃冰箱备用。
药物组：将上述6管含药PBS分别各取1ml放于不同的15ml离心管中，加含10%胎牛血清的DMEM培养液定容至10ml，分别配成10%含药的胎牛血清DMEM培养液（避免胎牛血清的干扰），做好标记，放4℃冰箱备用。
正常人关节软骨细胞的长期培养正常人关节软骨细胞的长期培养实验材料：1. 软骨细胞来源：20—24周自然流产胎儿的股骨和胫骨；2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1&time，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2；3. 消化液Ⅰ：2mg/ml胰蛋白酶和2mg/ml胶原酶混合消化液，用液配制；4. 消化液Ⅱ：0.5mg/ml胶原酶，用培养液Ⅰ配制；5. 培养液Ⅰ：DMEM培养液，补充10%胎牛血清；6. 培养液Ⅱ：DMEM培养液中补加10%胎牛血清、青霉素1000IU/ml、链霉素1mg/ml、两性霉素2.5μg/ml、谷氨酰胺2mmol/L、1%维生素添加剂（vitamin sulements）以及维生素C 50μg/ml；7. 10% poly HEMA：称取6g多聚2-羟乙基甲基丙烯酸酯（2-hydroxyet hylmethacrylate，poly HEMA），加到50ml 95%乙醇中，于37℃恒温振荡水浴箱中缓慢振荡过夜，次日将所得溶液离心（2500r/min，10mi n），除去未溶解的颗粒，此为干液。
取1ml干液与9ml 95%乙醇混合，稀释成10%（V/V）的poly HEMA溶液；8. 筛网：孔径为100μm的尼龙筛网；实验方法：1. 在无菌条件下，从20—24周自然流产胎儿的股骨头和胫骨坪切取骺软骨。
用液洗净血液。
尽量除去纤维性组织；2. 将软骨放入消化液Ⅰ中，于37℃孵育1h；3. 弃孵育液。
将软骨块充分切碎，加入消化液Ⅱ，在37℃孵育过夜；4. 用尼龙筛网过滤，滤液中加入培养液Ⅰ。
再经250g离心5min，弃上清液；5. 用培养液Ⅰ将细胞团吹散，重新悬浮细胞，离心。
重复4次。
用培养液将最后得到的细胞团制成悬液；6. 计数细胞。
从每克软骨平均可获得大约3.0&time108个软骨细胞；7. 取0.9ml 10% poly HEMA溶液铺在直径为60mm的塑料培养皿内，水平放置在通风的超净工作台上干燥（过夜）；8. 使用前将包被poly HEMA的培养皿用灭菌紫外灯照射30min；9. 将含5&time106个软骨细胞的悬液接种到已包被poly HEMA的培养皿中，在37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养；10.每3—4d换一次液。
实验方法各种溶液的配制1、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9（1）称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4.H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g（2）依次将各成分逐个溶解于800ml水中。
（3）用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。
（4）将酚红液（３）加入（２）中。
（5）补加水至1000ml，混匀。
（6）将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。
2、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml（1）称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。
（2）补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。
（3）冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。
（4）用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。
（5）分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。
3、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml（1）称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。
（2）补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。
（3）用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
（4）分装小瓶，低温冰箱保存备用。
4、配制闪烁液（1）用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。
（2）将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。
取材与培养（1）取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。
（2）无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。
（3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。
（4）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。
每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。
用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。
实验方法各种溶液的配制1、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9（1）称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4.H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g（2）依次将各成分逐个溶解于800ml水中。
（3）用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。
（4）将酚红液（３）加入（２）中。
（5）补加水至1000ml，混匀。
（6）将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。
2、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml（1）称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。
（2）补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。
（3）冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。
（4）用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。
（5）分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。
3、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml（1）称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。
（2）补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。
（3）用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
（4）分装小瓶，低温冰箱保存备用。
4、配制闪烁液（1）用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。
（2）将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。
取材与培养（1）取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。
（2）无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。
（3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。
（4）吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。
每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。
用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。
（5）用加了青霉素及链霉素的Hanks液洗1次，以同样方法再离心一次。
（6）过120目纱目，去除上清液。
（7）用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度至7.5X104。
（8）将细胞悬液接种于24孔培养板（1ml）及96孔培养板（200μm）中，24孔板及96孔板各2板。
（9）置于37℃、5%CO2孵箱中培养48小时。
更换部分培养基（1）用移液枪从24孔培养板中每孔吸出0.5ml旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
（2）同法从96孔培养板中每孔吸出100μl旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
加药按照预前设计给培养孔中加A药（牛膝健步）及B药（鹿茸生长素），具体加药方法如下图。
具体加药情况0.04%。
测定测II胶原的合成关节软骨细胞DNA的合成用3H TdR的掺入量来检测。
3号板加药后48小时加同位素3H TdR及3H脯氨酸（1）用1ml注射器抽取0.1ml 3H TdR （即0.1μci）(3H TdR及3H脯氨酸购买时浓度为1mci/ml)。
（2）加DMEM至0.5ml，将3H TdR配制成0.2 mci/ml浓度。
（3）同法配制相同数量的3H脯氨酸。
（4）根据试验前设计，按每孔5μl（即1μci）的量加入同位素。
（5）置于37℃、5%CO2孵箱中培育12小时。
测定同位素的量固定3号板细胞，测定同位素的量1、配置0.25%胰蛋白酶溶液（1）用电子天平称取0.25g胰蛋酶，放入烧杯内。
（2）加入少量的D-Hanks液，充分搅拌，使其成糊状。
（3）再加入D-Hanks液至100ml，不停搅拌，直至完全溶解。
2、固定细胞（1）用移液管将3号板（加药后48小时加同位素）各孔的培养液按顺序吸出并置入相应的试管内。
（1）往各孔内加入少量的0.25%胰蛋白酶溶液，并同时吹打细胞，使贴壁细胞消化脱落，消化不少于5分钟，形成细胞悬液，将细胞悬液再依次加入上面的相应试管内。
（2）将真空泵与玻璃纤维滤膜连接。
（3）用滴管依次将试管中的液体吸尽，滴加在玻璃纤维滤膜上，真空抽吸过滤。
（4）用注射器分别依次抽取2ml 5%三氯乙酸（细胞固定）、5ml蒸馏水（洗去多余的同位素）、1ml无水乙醇（细胞脱色），依次加至滤膜，使细胞固定在滤膜上。
（5）待真空泵将滤膜上的液体吸尽后，用镊子将滤膜取下，有序的置于托盘内。
（7）同上述3号板方法，根据试验前设计往4号板各培养孔中加入5μl（1μci）3H TdR或3H脯氨酸，并置于37℃、5%CO孵箱中培育12小时。
2（8）同昨日方法固定4号板细胞。
（9）将固定3号板及4号板细胞的滤膜依次置入对应的装有闪烁液的小塑料瓶内，闪烁液要覆盖滤膜。
3、用美国产BECKMAN LS6500 multi-purpose 液闪仪测定各孔细胞3HTdR或3H脯氨酸的掺入值。
MTT法测细胞增殖MTT染色(1) 用电子天平称量MTT染料0.02g。
（2）用DMEM溶解并稀释至4ml，PH值测定7.2。
（3）用0.22μm滤膜过滤除菌。
（4）根据试验前设计，往1号板与2号板相应的培养孔内，按0.1ml/孔加入MTT 染色液。
（5）置于37℃、5%CO2孵箱中培育5小时。
（6）按二甲基甲酰胺：Triton-X100：水=3：1：2的比例配置42ml脱色液（用柠檬酸调节PH至5～6）。
（7）按每孔1ml将脱色液加至1号及2号培养板相应的培养孔中。
（8）置于37℃、5%CO2孵箱中培育3小时，期间间歇振荡十分钟，使结晶充分溶解。
（9）用移液枪在1号板与2号板各孔中抽吸0.2ml溶液按顺序加入96板培养孔中。
（10）选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值。
甲苯胺蓝染色及蛋白多糖的测定甲苯胺蓝染色1、试剂配制：甲苯胺蓝乙醇液（甲苯胺蓝0.2g溶于30%乙醇100ml中）。
2、根据试验前设计，将行甲苯胺蓝染色的培养孔中的培养液吸去。
3、用PBS漂洗二次。
4、用70%乙醇固定30分钟。
5、用甲苯胺蓝乙醇液染20分钟。
6、倒置显微镜下观察并照相。
由于35-硫同位素试剂至今未买到,故软骨细胞体外培养后蛋白多糖的测定用甲苯胺蓝染色法完成。
软骨2-型胶原的合成用同位素标记的脯氨酸掺入量进行检测。
组织胺诱导软骨细胞凋亡及吖啶橙染色1 根据预前设计，往培养孔中加入30μl组织胺，置于37℃、5%CO2孵箱中继续培育24小时。
2 细胞离心，去上清后将细胞悬浮于50μlPBS中。
3 加入100μl吖啶橙染色液，混匀，置于冰中染色30分钟。
4 加入1。
85ml细胞固定液，混匀。
5 倒置显微镜观察。
6 进行流式细胞仪分析。
试剂DMEM培养基（Gibco）胎牛血清（FBS）：五江制药厂Ⅱ型胶原酶：Sigma，北京吉泰联科公司分装0.3%Ⅱ型胶原酶：取100mg胶原酶加入33ml D-Hanks液，0.22μm滤膜过滤；DMEM培养液：90mlDMEM+10mlFBS+0.1ml青霉素+0.1ml链霉素青霉素160万u加Hanks16ml，即10万u/ml链霉素100万u加Hanks10ml，即10万u/mlTrypsin（胰蛋白酶）：Gibco，邦定分装0.25%Trypsin：0.125g Trypsin加入50ml D-Hanks液中实验过程2002年12月13日星期五一、配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-91、称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na2Hpo4﹒H2o 0.06g, kH2po40.06g，NaHco30.35g，酚红0.02g2、依次将各成分逐个溶解于800ml水中。
3、用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。
4、将酚红液（３）加入（２）中。
5、补加水至1000ml，混匀。
6、将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。
二、配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml1、称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。
2、补足Hanks液至75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。
3、冷却至室温后，置4℃冰箱过夜。
4、用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。
5、分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。
三、配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml1、称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。
2、补足Hanks液至49.5ml，搅拌混匀。
3、用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
4、分装小瓶，低温冰箱保存备用。
四、取材1、取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。
2、无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎至1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。
3、吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。
4、吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。
每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。
用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。
5、用加了青霉素及链霉素的Hanks液洗1次，以同样方法再离心一次。
6、过120目纱目，去除上清液。
7、用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度至7.5X104。
8、将细胞悬液接种于24孔培养板（1ml）及96孔培养板（200μm）中，24孔板及96孔板各2板。
9、置于37℃、5%CO2孵箱中培养48小时。
2002年12月6日星期一一、更换部分培养基1、用移液枪从24孔培养板中每孔吸出0.5ml旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
2、同法从96孔培养板中每孔吸出100μl旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
二、加药：按照预前设计给培养孔中加A药（牛膝健步）及B药（鹿茸生长素），具体加药方法如下图。
具体加药情况0.04%。
2002年12月17日星期二一、配制闪烁液1、用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。
2、将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。
2002年12月18日星期三一、3号板加药后48小时加同位素3H TdR及3H脯氨酸1、用1ml注射器抽取0.1ml 3H TdR （即0.1μci）(3H TdR及3H脯氨酸购买时浓度为1mci/ml)。
2、加DMEM至0.5ml，将3H TdR配制成0.2 mci/ml浓度。
3、同法配制相同数量的3H脯氨酸。
4、根据试验前设计，按每孔5μl（即1μci）的量加入同位素。
5、置于37℃、5%CO2孵箱中培育12小时。
2002年12月19日星期四一、MTT染色1、用电子天平称量MTT染料0.02g。
