免疫组化实验步骤及配
方
文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
免疫组化步骤
1. 多聚甲醛灌流取材，多聚甲醛后固定，30%多聚糖溶液沉糖;
2. 冰冻切片（1d-14d 脊髓>=20μm;14d-28d>=10μm;DRGd=10μm ）
3. 0.01MPBS 洗10min ×3次;
4. 1NHCL 暴露抗原30min ；
5. 去离子水洗，0.01MPBST 洗10min ×3次；
6. 3%双氧水(0.01MPBS 配制)洗10min ，灭活内源性HRP ；
7. 0.01MPBST 洗10min ×3次；
8. 5%-10%血清封闭30min （0.01MPBST 配制）；
9. 一抗过夜，一抗用PBST 稀释；
10. 0.01MPBS 洗10min ×3次，二抗3孵育小时；
11. 0.01MPBS 洗10min ×3次，HRP-亲和素3小时；
12. 0.01MPBS 洗10min ×3次，DAB 显色12-18min 。
免疫组化常用试剂配制
1. 0.1MPB:14.5gNa 2HPO 4·12H 2O
500mLH 2O
1.5gNaH 2PO 4·2H 2O
2. 0.1MPBS:500mL0.1MPB
45gNaCl
3. 0.01MPBST:100mL0.01MPBS
10滴TritonX-100
4.INHCL:盐酸：水=1：10
5.4%多聚甲醛：13.6gKH 2PO 4
3.6gNaOH
40g 多聚甲醛
1000mLH
2
O
注：1).需要60°C加热溶解，过滤使用；
2).多聚甲醛每次比需要多称10g，以弥补后面过滤的损失；
3).现将多聚甲醛溶于1000mL水中，然后一边加热搅拌一边缓慢加入多聚甲醛的助溶剂
NaOH，待NaOH和多聚甲醛都完全溶解后再加入KH
2PO
4
，溶后过滤备用。
6.DAB液：以0..1MPB配制，DAB浓度0.05%，H
2O
2
浓度0.03%。
注：1).H
2O
2
临用时再加；
2).用DAB染后用0.01MPB洗。
7.30%蔗糖：150g蔗糖
500mL4%多聚甲醛
注：可同时沉糖后固定。
8.封闭液：10%山羊血清（做免疫荧光时另加0.1%BSA）。
