分子克隆方法之同源克隆方法

同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆是一种常用的基因克隆方法，用于获取目的基因的DNA序列。

同源序列法克隆的主要步骤如下：1. 设计引物：根据已知目的基因的序列，设计一对引物（即寡核苷酸片段），其中一个引物具有与目的基因的5'端相互匹配，另一个引物具有与目的基因的3'端相互匹配。

2. 提取模板DNA：从包含目的基因的源生物体中提取总DNA 或特定组织/细胞中的DNA作为模板。

3. 聚合酶链反应（PCR）扩增：在PCR反应中使用设计的引物和模板DNA来扩增目的基因的DNA序列。

PCR反应通过多次循环加热和冷却来产生大量DNA复制品。

4. 凝胶电泳分析：将PCR扩增产物与分子量标记物一起加载在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。

通过比较扩增产物与标记物在凝胶上的迁移距离，可以确定是否成功扩增了目的基因。

5. 纯化目的基因：从PCR反应中纯化目的基因的扩增产物，一般使用凝胶切片、DNA纯化试剂盒等方法。

6. 连接到载体：将纯化的目的基因DNA与适当的载体（如质粒）进行连接。

这通常涉及酶切目的基因和载体的DNA，然后使用连接酶将它们连接在一起。

7. 转化宿主细胞：将连接的DNA导入宿主细胞中，使其自行复制和表达。

这可以通过转染、电穿孔或热激冲等方法实现。

8. 筛选与鉴定：通过对转化后的细胞进行选择性培养或检测，筛选出带有目的基因的克隆。

常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选等。

9. 验证目的基因：最终需要验证克隆中是否成功插入了目的基因。

这可以通过DNA测序、限制性酶切、PCR等方法来进行。

同源序列法克隆是一种有效的基因克隆技术，可用于获得感兴趣的基因序列并进一步研究其功能、表达和调控机制等。

Word-可编辑第八章基因克隆基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组ＤＮＡ技术，是应用酶学主意，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、衔接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中举行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。

克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。

一个残破的基因克隆过程包括以下步骤：１、获得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因与载体在体外衔接；３、重组DNA分子导入宿主细胞；４、筛选、鉴定阳性重组子；５、重组子的扩增与／或表达。

第一节重组DNA中常用的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA衔接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等，一、限制性内切酶的定义、命名和分类限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。

限制性核酸内切酶的来源：细菌的限制－修饰系统。

分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第Ⅱ类。

限制性核酸内切酶的命名。

二、限制性核酸内切酶的作用特点1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称（即具有迥文结构）；2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端；3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端。

4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶，如MboI Ⅰ和Sau3A。

千里之行，始于足下三、其它工具酶参考“分子克隆”（Sambrook,J et al . molecular cloning）第二节载体－宿主系统一、概述载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞举行扩增和表达的DNA,它们普通是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。

载体应具备以下条件：１、能在适当的宿主细胞中复制；２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。

同源重组法分子克隆 -回复同源重组法是分子克隆技术中的一种重要方法，其基本原理是利用DNA的同源性重组来插入外源DNA序列到宿主DNA中。

同源重组法在基因克隆、遗传工程等领域得到了广泛应用。

本文将详细介绍同源重组法的原理、步骤及应用。

一、同源重组法的原理同源重组法的原理基于DNA分子的自身结构和功能，DNA分子在某些条件下能够进行重组、修复和重复。

同源重组是指两个DNA分子之间具有相似序列（同源）的区域进行交换而形成的DNA分子重组。

同源重组法基于此原理，通过在宿主DNA中引入重组的同源片段，将外源DNA序列插入到宿主DNA中。

同源重组法的原理可以分为两个步骤：相互间接断裂和互补配对。

两个DNA分子的同源片段同时发生间接断裂，获得可供基因重组的末端。

接下来，由于互补配对的作用，从两个DNA分子中间的同源片段在一定条件下进行配对，形成插入、缺失、互换等不同类型的重组产物。

1. 构建载体DNA：载体DNA是将外源DNA插入到宿主DNA中的重要工具，构建载体DNA 需要选择有适当限制酶切位点的载体和外源DNA。

一般来说，常用的载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样颗粒等。

2. 制备DNA片段：外源DNA片段可以通过PCR扩增、酶切和DNA合成等技术制备。

需要注意的是，PCR扩增要确保扩增的DNA片段与宿主DNA具有一定的同源性。

3. 利用限制酶切割载体和外源DNA：根据预定的酶切位点设计限制酶切位点并进行酶切。

4. 进行杂交和拼接：将外源DNA片段与载体DNA杂交，并通过互补配对将DNA片段与载体DNA进行拼接。

5. 转化大肠杆菌：利用化学方法或电击法将构建好的载体DNA转化到大肠杆菌中，转化后得到含外源DNA的菌落。

6. 筛选阳性菌落：利用选择性培养基和荧光素酯分析方法等技术筛选阳性菌落。

7. 测序鉴定：对筛选出的阳性菌落进行测序，并鉴定插入的外源DNA序列是否正确。

同源重组法是分子克隆领域中一种非常实用的技术。

同源序列克隆法抗病基因的分离、克隆不仅有助于我们深入理解植物－病原物的识别过程及其专性抗病分子机制，而且对于作物的抗病育种具有极大的应用价值。

1992 年，第一个抗病基因Hml被克隆 (Johal and Briggs, 1992) 。

迄今已经从不同植物中克隆了约 50 个抗病基因，分别赋予植物体针对病毒、细菌、真菌、线虫和昆虫等广泛病原物类型的特异性抗性（汪旭升等， 2005 ）。

尽管这些基因来自上十个不同的植物种属，特异识别的病原物类型各自不同，其核苷酸序列的同源性也较低，但是，其编码的蛋白质产物在结构上却有极大相似性，它们都拥有一些共同的结构域，如富含亮氨酸重复序列（ LRR ）、核苷酸结合位点（ NBS ）、丝氨酸－苏氨酸激酶区域（ STK ）、 Toll 和白介素－ 1 区域（ TIR ）和亮氨酸拉链（ LZ ）等。

考虑到尚未被克隆的抗病基因其编码产物可能也存在类似结构域， 90 年代，许多研究者便提出了利用同源序列法快速克隆抗病基因的设想，其基本思路便是依据这些结构域中的高度保守区域，设计特异性的简并引物，通过 PCR 扩增 R 基因同源序列（ Resistance gene analogs, RGAs ），最后利用这些 RGAs 来快速分离 R 基因。

同源序列法克隆抗病基因相对于传统方法具有一定的优越性。

传统的基因克隆方法主要有图位克隆法和转座子标签法，这两种方法都相当耗时耗力，并且在应用上有一定限制。

例如大麦和小麦等作物的基因组较大并且重复序列较多，很难构建高密度的分子标记连锁图谱，因而图位克隆法分离基因相对困难；果树难以建立理想的分离群体，同时又缺乏合适的转座子系统，因此经典克隆抗病基因的方法都不适合。

同源序列法分离 RGAs 的过程快速、简捷，并且应用上没有限制，因而能够在广泛植物中得到普遍应用。

目前，已经从大豆（ Kanazinet al., 1996 ）、豌豆（ Timmerman-Vaughan et al., 2000 ）、马铃薯 ( Leister et al., 1996) 、番茄 (Zhang et a1., 2002) 、柑橘 (Deng et al., 2000) 、苹果（ Lee et al., 2003 ）、葡萄 ( Donaldet al., 2002) 、辣椒（ Pflieger et al., 1999 ）、莴苣（ Shen et al., 1998;Meyers et al., 1998 ）、亚麻（ Dodds et al., 2001 ）、拟南芥（ Aarts et al,. 1998 ）、玉米 (Collins et al., 1998,1999 and2001 ; Ramalingam et al., 2003 ) 、水稻 (Wang 等，1998;Chen et al., 1998; Leister et al., 1998 and1999; Mago et al., 1999; Wang and Xiao, 2002) 、大麦 ( Leister et al., 1999; Mohler et al., 2002;Madsen et al., 2003 ) 、小麦 ( Feuilletet al., 1997;Chen et al., 1998) 等植物中扩增出大量 RGAs ，并利用这些 RGAs 鉴定到一些抗病候选基因。

同源克隆法原理和方法同源克隆法呀，那可是个很有趣的东西呢。

同源克隆法的原理就像是找失散多年的亲人一样。

它基于基因的同源性，也就是相似性啦。

如果把基因比作一群有着家族特征的人，那些有着高度相似序列的基因就像是近亲。

我们可以根据已知的基因序列信息，在其他生物或者同一生物的不同组织里找到相似的基因。

这就像是凭借着家族的一个特征去找到其他有同样特征的家族成员。

那它的方法呢？首先得有一个已知的基因片段或者序列，这就像是我们有了一个家族成员的线索。

然后提取目标生物的基因组DNA，这基因组DNA就像是一个装满各种宝藏信息的大盒子。

接着利用设计好的引物，引物呢就像是一把精准的钥匙，只能打开特定的基因锁。

通过PCR技术来扩增可能存在的同源基因。

这个过程就像是一场寻宝游戏，我们拿着钥匙在大盒子里寻找我们想要的宝贝。

在这个过程中呀，要注意引物设计一定要准确，可不能马虎，就像你要去参加一场很重要的比赛，准备工作得做足了。

同源克隆法的安全性嘛，哎呀，那还挺不错的呢。

因为它主要是在基因层面操作，只要遵循实验室的规范操作，就像我们遵守交通规则一样，不会有太大的危险。

不会突然像个调皮的小鬼一样搞出什么大麻烦。

它的稳定性也比较可观，只要实验条件合适，就像植物在适宜的环境里生长一样，结果是比较可靠的。

它的应用场景可多啦。

在植物育种方面，就像是给植物做一场基因升级。

比如说，想要提高作物的抗病虫害能力，就可以用同源克隆法找到抗病虫害相关的基因，然后把它转到作物里。

这就好比给作物穿上了一层坚固的铠甲。

优势也很明显呀，它相对比较简单直接，不需要特别复杂的设备和技术，这难道不棒吗？这就像你不需要开着豪车也能到达目的地一样。

给你说个实际案例吧。

在水稻育种中，科学家想要提高水稻对盐碱地的耐受性。

他们就利用同源克隆法找到了一些在耐盐碱植物里存在的同源基因，然后把这些基因转到水稻里。

哇塞，结果水稻真的就像个坚强的战士一样，在盐碱地里也能茁壮成长啦。

简介（INTRODUCTION）原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。

它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。

装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）,高保真DNA聚合酶。

（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。

首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。

然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA 单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。

最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。

这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。

下面是组装的示意图。

材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000，2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。

如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。

4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到7.5 mL，每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion(1× ) 25 μL4× G.A. buffer 500 μL加水365 μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。

同源重组的克隆方法**《同源重组的克隆方法》**嘿，朋友！今天我要跟你唠唠同源重组的克隆方法，这可是个超级厉害的技术哟！首先，咱们得搞清楚啥是同源重组。

这就好比是两个失散多年的双胞胎，突然在茫茫人海中找到了彼此，然后手拉手紧紧拥抱在一起。

在分子生物学里呢，就是两段有相似序列的 DNA 片段，它们就像那对双胞胎一样，能精准地连接在一起。

那开始咱们的第一步，准备工作得做好！就像你要出门旅行，得先把行李收拾妥当。

你得有要克隆的目标 DNA 片段，还有载体 DNA ，这载体就像是一辆小货车，负责把咱们的目标 DNA 拉到目的地。

还有各种酶，比如限制性内切酶，这玩意儿就像是一把小剪刀，能把 DNA 剪成咱们想要的片段。

然后呢，进入第二步，用限制性内切酶把目标 DNA 和载体 DNA 都剪一剪。

这时候你得小心，别剪错地方啦，不然就像你出门剪坏了衣服，那可就尴尬喽！剪完之后，就得到了有粘性末端的 DNA 片段。

接下来第三步，这可是关键的一步！把剪好的目标 DNA 和载体DNA 放在一起，就像让两个拼图的边缘对齐。

这时候，它们那些相似的序列，也就是同源序列，就开始发挥作用啦，它们会互相吸引，就像磁铁的两极。

然后在一些酶的帮助下，比如 DNA 连接酶，它们就紧紧地连接在一起，形成了一个重组的 DNA 分子。

第四步，把这个重组的 DNA 分子转到细菌或者其他细胞里，让它们帮咱们复制和表达。

这就好比是把种子种到地里，等着它发芽长大。

我跟你说，我自己刚开始弄这个的时候，那真是状况百出。

有一次我着急忙慌地做实验，结果把酶加错了，那感觉就像是上错了车，完全跑偏啦！还有一次，我不小心把 DNA 样本弄混了，搞得我自己都晕头转向，简直是一场灾难！但是别怕，只要咱们按照步骤，一步一步来，多练习几次，肯定能掌握这个同源重组的克隆方法。

最后再跟你强调一下哈，每一步都得细心，准备工作要充分，酶不能加错，操作的时候要稳准狠。

相信我，等你熟练掌握了这个方法，那感觉就像是拥有了一把神奇的钥匙，可以打开好多科学的大门！好啦，朋友，快去试试这个同源重组的克隆方法吧，祝你成功！。

简介（INTRODUCTION）原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。

它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。

装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）,高保真DNA聚合酶。

（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。

首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。

然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA 单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。

最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。

这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。

下面是组装的示意图。

材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000，2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。

如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。

4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到7.5 mL，每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion(1× ) 25 μL4× G.A. buffer 500 μL加水365 μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。

分子克隆技术（质粒DNA和DNA插入片段的制备、连接反应以及重组质粒的转化）克隆（Clone）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。

分子克隆（Molecular Cloning）是指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全相同的分子群，发生在基因水平上的分子克隆称基因克隆（DNA克隆）。

其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。

由于质粒具有不相容性，即同一类群的不同质粒常不能在同一菌株内稳定共存，当细胞分裂时就会分别进入到不同的子代细胞中，所以来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。

（一）质粒DNA的制备质粒是存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环DNA分子，它能赋予细菌（宿主细胞）某些特定的遗传表型。

质粒并非细菌生长所必需，但由于其编码一些对宿主细菌有利的酶类，从而使宿主细菌具有抵抗不利自身生长的因素如抗药性等的能力。

目前发现的质粒主要分为F质粒（性质粒），R质粒（抗药性质粒），E.coli质粒（大肠杆菌肠毒素质粒）。

根据质粒在一个细胞周期内产生拷贝的数量，可将质粒分为严紧型（低拷贝，复制1-2次）和松弛型（高拷贝，复制10-200次）。

由于质粒的不相容性细菌经分裂后就只留下了拷贝数较高的一种质粒，例如R1和R2两种抗药性质粒同属于一类，由于不相容性使它们不能共存于同一细菌中，但不同类群的质粒可以在一个细菌中共存。

质粒存在于细菌中，所以制备质粒DNA时，首先应将含有质粒的细菌在含有相应抗生素的液体培养基中生长至对数期,使质粒在细菌中得到扩增。

通过离心收集细菌，经碱裂解细菌，使质粒和细菌染色体DNA变性，然后再加中和液，使溶液PH值恢复到中性，这样质粒DNA又可以复性至天然双链构象状态，而细菌染色体DNA不能或很难复性所以仍处在变性状态，这些变性的染色体DNA与变性蛋白质缠绕在一起，易被离心去处，而质粒DNA仍存在于水相中，再用无水乙醇沉质粒DNA，最后经离心即可得到质粒DNA。