分光光度测色仪的构成和使用.

分光光度计的使用一、分光光度计的基本元件分光光度计根据使用的波长范围不同可分为紫外光区、可见光区和红外光区分光光度计。

无论哪一类分光光度计都包括五个基本部件:光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。

分光光度计各部件的次序如下图所示:分光光度计基本结构示意图(一)光源分光光度计上常用的光源有两种: 钨丝灯或氢灯。

在可见光区、近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光源，其工作温度约为2870°K。

钨丝灯的灯丝为紧密螺旋形，若将灯丝对准仪器光学装置的轴线时，能在出光狭缝的平面上投射光亮均匀的直线影象。

钨丝灯的缺点是在短波长(<350nm)处辐射强度小,而且必须小心地控制流至灯上的电流才能维特恒定的强度。

在紫外光区多使用氢弧灯。

氢灯内充有低压氢气，在两极间施以一定电压来激发氢分子可发出紫外光。

因玻璃吸收紫外线(光学玻璃的透射范围为340-1000nm)，所以氢灯的泡壳用石英制成(石英的透射范围为185-3500nm)，或在灯泡的发光处开一石英窗。

若用氘灯代替氢灯，虽发射的波长范围相同，但在紫外光区的发射强度可增加三倍之多。

因氘灯价格昂贵,一般很少使用。

(二)单色器单色器是把混合光波分解为单一波长光的装置。

在分光光度计中多用棱镜或光栅作为色散元件。

1、棱镜光波通过棱镜时，不同波长的光折射率不同。

波长愈短，传播速度愈慢,折射率也愈大;反之,波长愈长,传播速度愈快，折射率则愈小。

因而能将不同波长的光分开。

因为玻璃对紫外线的吸收力强，故玻璃棱镜多用于可见光分光光度计。

石英和熔凝石英(fused silica)棱镜可在整个紫外光区传播光，故在紫外光分光光度计中广为应用。

熔凝石英虽比石英在短波长方面更易传播光，但因价格昂贵,仅在需要高强度辐射时,才被使用。

2、衍射光栅在石英或玻璃的表面上刻划许多平行线(每英寸约刻15,000-30,000条)。

由于刻线处不透光，通过光的干涉和衍射使较长的光波偏折角度大,较短的光波偏折角度小,因而形成光谱。

简述分光光度计的主要部件分光光度计是一种常用的实验室仪器，可以测量物质的吸收光谱并计算出其浓度。

它由主要部件光源、光栅、样品室、检测器以及计算机等组成。

首先，光源是分光光度计的核心之一，它通常采用高亮度的氘灯或钨灯作为光源。

在光谱测量中，光源会发出连续的光线，在经过光栅的分光作用后，被分解成不同波长的光谱，随后进入样品室进行测量。

其次，光栅也是分光光度计重要的组成部分，它能够将光线按照波长进行分散，使不同波长的光线依次落在检测器的不同位置。

市面上常见的光栅有反射式光栅和透射式光栅两种，反射式光栅通常用于紫外光谱仪，透射式光栅则通常用于可见光谱仪。

第三，样品室是分光光度计进行样品测量的空间，它通常由一个光学透明的、可调节的容器组成，可以根据不同的实验需要选择不同大小的室内空间。

在进行样品测量时，样品会放置在容器中，同时光谱仪测量系统会通过容器壁将可见光或紫外光辐射到样品中，测量样品对于不同波长光的吸光度，从而得到样品的光谱图像。

第四，检测器是分光光度计实现信号转换和放大的重要元件。

在可见光谱仪中，常用的检测器有光电二极管、电荷耦合器件（CCD）、钙钛矿光电二极管等等。

而在紫外光谱仪中，探测器的类型则有气冷化硅探测器、气冷化铟探测器、碲化锡探测器等等。

最后，分光光度计的计算机部分也是其不可缺少的部分。

计算机通过控制调节样品室温度及空气流通，控制光源光强、波长、光栅角度等参数，以及记录和处理测量数据。

将测量得到的样品数据进行处理，通过校准曲线得到样品的浓度，而且现在随着技术的发展，现代分光光度计已经可以实时输出光谱图像，让实验室工作者在测量中可以更加方便的观察光谱曲线。

分光光度计的结构分光光度计是一种分析化学仪器，它使用光学原理来分析物质的吸收和透射性。

分光光度计的结构如下。

1.光源:分光光度计的光源可以是白炽灯、氙气灯、汞灯等。

白炽灯只适用于可见光区域，而氙气灯和汞灯可以产生可见光和紫外线。

2.单色器:分光光度计使用单色器，将来自光源的多种不同波长的光线分离成单一的波长。

单色器通常使用棱镜或光栅。

棱镜将光线折射，使不同波长的光线拐向不同的角度，让它们分开，形成彩虹光束。

光栅通过一列规则的平行的凸起和凹陷来分离光线，将不同波长的光弹回不同的方向。

3.光路:从单色器开始的光路将光引向样品室。

样品室包含容器，用于保持待分析的液体样品或固体样品溶解液。

样品室中的样品是分析的目标，因为它们会吸收特定波长的光线。

4.检测器:检测器位于样品室的另一端，用于测量透射的光线的强度。

检测器可以是光阵列检测器或光电倍增管。

光阵列检测器包含许多单个探测器，在一个板上部署。

光线穿过样品室时，打在探测器阵列上，测量每个波长的透射度。

光电倍增管则将光线转化为电信号，并将信号放大。

5.计算机:计算机与分光光度计联通，用于对光强度数据进行处理和分析。

计算机可以计算样品的吸收度，并将其与一个标记样品相比较，以确定样品中吸收的光的程度。

以上是分光光度计的基本结构。

在实际应用中，分光光度计也可以加装附件，比如通过气流或水管将样品热至适当的温度，或连接运动芯片来检测某些化学品的存在。

这些附加功能可以扩展分光光度计的应用范围，并使分析更准确。

简述分光光度计的基本组成分光光度计是实验室中使用频次很高的仪器，就其基本结构来说,都是由五个基本部分组成,即光源、单色器、吸收池、检测器及数据系统。

今天就光源、单色器、吸收池、检测器这四部分给大家简单介绍分光光度计由哪些部分组成，以及在选择分光光度计时应该如何选型？1、分光光度计光源分光光度计的光源采用了两种类型的灯，在紫外波段测量时用重氢灯，在可见光和近红外波段测量时采用钨灯。

2、分光光度计分光器分光光度计分光镜的作用是从光源（白光）中提取单色光，分光器有滤镜型、棱镜型和光栅型（衍射光栅）几种。

滤镜：可用滤镜拣选出单一波长的光线。

还可以将滤镜与衍射光栅结合起来使用，以将杂散光滤出。

棱镜：可对175-2,700 nm的光谱范围进行散射。

散射程度取决于波长。

衍射光栅：散射范围遍及所有波长，可通过衍射光栅获得很广的波长范围。

此外，可通过恒定的狭缝宽度获得恒定的光谱。

3、分光光度计样品池放置样品的容器被称为“池”，有两种类型的池：玻璃和石英池。

由于340 nm 以下的紫外波段的光线很难透过玻璃池，因而玻璃池用于340 nm以上的可见光波段的测量。

相反，虽然石英池允许紫外与可见光波段所有波长的光线通过，但考虑到其价格昂贵，主要用于紫外波段的测量。

4、分光光度计检测器检测器的作用是将样品的透射光转换为电信号。

可采用光学半导体或各种类型的光电倍增管作为检测器。

光学半导体：在紫外到近红外波段具有高速、高敏感性和低噪音的特点。

采用只对可见光波段敏感的光电池。

硅光电二极管是具有代表性的一种光学半导体。

光电倍增管：光电管与放大器（约10倍放大率）的结合，对紫外线和可见光波段均敏感，可通过调整施加的电压对敏感度进行大幅度调整。

分光光度计的操作步骤与注意事项光度计操作规程分光光度计，又称光谱仪（spectrometer），是将成分多而杂的光，分解为光谱线的科学仪器。

测量范围一般包括波长范围为380～780 nm的可见光区和波长范围为200～380 nm的紫外光区。

不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可接受不同的发光体作为仪器的光源。

钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的380～780nm波长的光谱光通过三棱镜折射后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫构成的连续色谱；该色谱可作为可见光分光光度计的光源。

操作步骤1）预热仪器。

为使测定稳定，将电源开关打开，使仪器预热20min，为了防止光电管疲乏，不要连续光照。

预热仪器时和在不测定时应将比色皿暗箱盖打开，使光路切断。

2）选定波长。

依据试验要求，转动波长调整器，使指针指示所需要的单色光波长。

3）固定灵敏度档。

依据有色溶液对光的吸取情况，为使吸光度读数为0.2—0.7，选择合适的灵敏度。

为此，旋动灵敏度档，使其固定于某一档，在试验过程中不再变动。

一般测量固定在“1”档。

4）调整“0”点。

轻轻旋动调“0”电位器，使读数表头指针恰好位于透光度为“0”处（此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断，光电管不受光照）。

5）调整T=百分之一百。

将盛蒸馏水（或空白溶液或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的首格内，有色溶液放在其它格内，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，转动光量调整器，使透光度T=百分之一百，即表头指针恰好指在T=百分之一百处。

6）测定。

轻轻拉动比色皿座架拉杆，使有色溶液进入光路，此时表头指针所示为该有色溶液的吸光度A。

读数后，打开比色皿暗箱盖。

6）关机。

试验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。

注意事项1）为了防止光电管疲乏。

不测定时必需将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。

2）比色皿的使用方法：①拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。

分光光度计的原理与使用一、目的要求：1、学会紫外-可见分光光度计的原理和使用方法2、学会测量溶液的浓度.二、实验原理：1、分光光度计原理：分光光度计是目前化验室中使用比较广泛的一种分析仪器,其测定原理是利用物质对光的选择性吸收特性,以较纯的单色光作为入射光,测定物质对光的吸收,从而确定溶液中物质的含量.其特点是灵敏度高；准确度高；测量范围广；在一定条件下,可同时测定水样中两种或两种以上的物质组分含量等.分光光度计按其波长范围可分为可见分光光度计〔工作范围360～800nm〕、紫外-可见分光光度计〔工作范围200～1000nm〕和红外分光光度计〔工作范围760～400000nm〕等.2、在日常使用与维护当中应注意以下几点：第一,在使用仪器前,必须仔细阅读其使用说明书.第二,若大幅度改变测试波长,需稍等片刻,等灯热平衡后,重新调零与满度后,再测量.第三,指针式仪器在未接通电源时,电表的指针必须位于零刻度上.若不是这种情况,需进行机械调零.第四,操作人员不应轻易触动灯泡与反光镜灯,以免影响光效率.第五,放大器灵敏度换挡后,必须重新调零.第六,比色皿使用时要注意其方向性,并应配套使用,以延长其使用寿命.新的比色皿使用前必须进行配对选择,测定其相对厚度,互相偏差不得超过2%透光度,否则影响测定结果.使用完毕后,请立即用蒸馏水冲洗干净〔测定有色溶液后,应先用相应的溶剂或〔1+3〕的硝酸进行浸泡,浸泡时间不宜过长,再用蒸馏水冲洗干净〕,并用干净柔软的纱布将水迹擦去,以防止表面光洁度被破坏,影响比色皿的透光率.第七,比色皿架与比色皿在使用中的正确到位问题.首先,应保证比色皿不倾斜.因为稍许倾斜,就会使参比样品与待测样品的吸收光径长度不一致,还有可能使入射光不能全部通过样品池,导致测试准确度不符合要求.其次,应保证每次测试时,比色皿架推拉到位.若不到位,将影响到测试值的重复性或准确度.第八,干燥剂的使用问题.干燥剂失效将会导致以下问题：①数显不稳,无法调零或满度.②反射镜发霉或沾污,影响光效率,杂散光增加.因此分光光度计应放置在远离水池等湿度大的地方,并且干燥剂应定期更换或烘烤.第九,分光光度计的放置位置应符合以下条件：避免阳光直射；避免强电场；避免与较大功率的电器设备共电；避开腐蚀性气体等.3、吸光光度法测定溶液浓度原理基于物质对不同波长的光波具有选择性吸收的能力而建立起来的分析方法. 〔1〕光线：光线的波长： 200nm-400nm 紫外线,400-750nm可见光, >750nm 红外线光具有波粒二相性,波长不同,其能量不同.〔2〕物质的吸收光谱与颜色：A．物质的原子吸收光谱和原子发射光谱：原子的最外层电子可以选择性吸收特征波长的电磁波成为激发态而产生的光谱称为原子吸收光谱.激发态原子恢复到基态,则释放出特征波长的光子,形成原子发射光谱.不同的溶液其光谱不同,即不同溶液对不同波长的光其吸收能力不同,对某一特定波长的光存在吸收峰. B．可见光由赤橙黄绿青兰紫等能量不同的光线组成,当可见光穿过某一溶液时,由于特定波长的光被吸收而使溶液呈现相应的颜色.〔如CuSO4由于吸收了可见光中的黄光<600nm>而成蓝色〕不同颜色的溶液对不同波长的光其吸收能力不同. 〔3〕光吸收的基本定律〔Lambert-Beer 定律〕：一束平行单色光〔Io〕通过有色的透明溶液时,一部分的光可以透过溶液〔It〕,另一部分被溶液吸收〔Ia〕,还有一部分被器皿表面反射〔Ir〕,则：Io=It+Ia+Ir .那么,该溶液透光率为: T = It / Io .1． Lambert 定律：设有一束平行单色光,通过液层厚度为b 的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力:A=Ig<Io/It>=Ig<1/T>=k2bk2 为吸光系数,为常数.与入射光波长、溶液性质、浓度和温度有关；A 为吸光度〔又称光密度O.D 或消光度E〕,当入射光波长、吸光溶液的浓度和温度一定时,A 与b 成正比.2． Beer 定律：设有一束平行单色光,通过浓度为c 的均匀透明溶液,则溶液对光的吸收能力:A=lg<Io/It>=Ig<1/T>=k4ck2 为常数.由Beer 定律可知：当入射光波长、吸光溶液的厚度和温度一定时,A 与c 成正比.3． Lambert-Beer 定律：综合1.2.得： A=Kbc ,即：当入射光波长、吸光溶液的性质和温度一定时,A 与b、c 成正比.〔4〕吸光光度法的基本原理：1、不同物质,由于其分子结构和原子组成不同,故对光的吸收光谱不同〔如：CuSO4〕,在测定不同颜色的物质浓度时要用最大吸收的波长的入射光,这样测量的灵敏度最高.2、同一种物质,若浓度不同,则对同一波长的入射光的吸收能力〔吸光度〕也不同,且成正比关系.3、应此,利用特定波长的单色光〔通常用最大吸收波长的入射光〕照射不同浓度的某一溶液时,所得的吸光度大小应与溶液浓度呈线性关系,故可利用该线性关系通过计算或查标准曲线来求得未知溶液的浓度.〔5〕吸光光度法特点：1．灵敏度高：mg%级、甚至ug%级.2．准确度高：误差2-5%3．操作简便、快速,仪器设备不复杂,价格低廉,故应用广泛.三、实验器材：UV2000分光光度计四、实验步骤〔一〕 UV2000 型分光光度计的使用与注意事项1、插上插头,接通电源,打开暗箱盖,预热20min.* 注意：分光光度计在接通电源而不用时,必须打开暗箱盖,以免光电管老化.2、将准备好的试剂倒入比色杯中,用吸水纸擦去比色杯外侧水珠,并依次放入比色杯架中.* 注意：手拿比色杯毛面,试剂倒入杯中满2/3 即可,不得将比色杯放在仪器上.3、调节所需波长,选择功能至"T".4、调"0"：放入挡光板,按调"0"键调节.5、调"100%"：取出挡光板,盖上暗箱盖,调"100%",让光线通过"空白管".6、重复调"0"和调"100%"数次.7、将选择键由"T"调至"A",此时读数应由"100"至"0",若不为"0",可用"0%"键调节.8、拉动拉杆,分别读取"A 标"和"A 样".9、取出比色杯,弃去溶液,洗净晾干,备用.〔二〕计算1．利用标准管计算测定物含量：A 样=K 样b 样c 样A 标=K 标b 标c 标因为入射光的波长,溶液性质和温度以与比色杯的厚度都一样,即：K 样=K 标 b 样=b 标所以：A 样/ A 标= c 样/ c 标得：c 样= c 标×A 样/ A 标2．利用标准曲线进行计算：3．偏离Lambert-Beer 定律的原因1〕由于非但色光引起的偏离.2〕由于溶液本身原因引起的偏离：①由于介质不均匀引起的偏离②由于溶液中化学反应引起的偏离浓度的测定〔三〕CuSO4比色波长=650nm按上述操作步骤测定硫酸铜溶液A 样和A 标,按下式计算样品浓度：C 样 = C 标 * A 样 / A 标五、结果与思考1、如果用标准曲线法测定硫酸铜溶液浓度,该如何设计实验？2、分光光度计的维护要注意什么？3、比较各种分光光度计的使用范围.。

应用分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。

常用于核酸、蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。

我们实验室主要是用来测物质的光度以求得物质的浓度或者酶活。

基本原理分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。

它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息，可以用标准光谱图再结合其它手段进行定性分析。

朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即A= kcl式中比例常数k与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。

c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。

组成各种型号的紫外－可见分光光度计，就其基本结构来说，都是由五个基本部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器及信号指示系统。

1.光源在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源。

热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。

2．单色器单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。

单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。

色散元件常用棱镜和光栅。

3.吸收池吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。

吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。

4、检测器检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。

现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。

5、信号显示系统常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。

操作步骤操作之前1.1开启电源进行初始化开启主机电源，分光光度计将按屏幕所显示的项目进行自检和初始化，如下图所示。

所有项目检测完毕，初始化结束，整个过程大约需要4min（若使用多池检测需5min）。

每个项目进行初始化操作时将被加亮显示，当初始化完成后，该项右边的星标也将加亮显示。

分光光度计使用原理及操作方法分光光度计使用原理及操作方法1、引言1.1 本文档旨在介绍分光光度计的使用原理及操作方法，以便读者能够正确并有效地操作分光光度计。

2、分光光度计的原理2.1 光的特性2.1.1 光的波粒二象性2.1.2 光的频率和波长2.1.3 光的传播速度2.2 光的吸收和透射2.2.1 原子、分子和离子的能级2.2.2 原子、分子和离子的吸收和透射2.3 分光光度计的工作原理2.3.1 光源和单色器2.3.2 样品室和探测器2.3.3 数据处理和显示3、分光光度计的操作方法3.1 仪器准备3.1.1 确保光源和单色器正常工作 3.1.2 清洁样品室和探测器3.2 样品的处理3.2.1 准备待测样品3.2.2 设置参比样品3.3 测量操作3.3.1 设置光强度和波长范围3.3.2 执行空白测量3.3.3 执行样品测量3.4 数据处理3.4.1 计算吸光度3.4.2 绘制吸光度-波长曲线3.4.3 分析实验结果4、附件本文档不包含附件内容。

5、法律名词及注释5.1 光的波粒二象性：光既可以像波一样传播也可以像粒子一样进行相互作用5.2 光的频率和波长：光的频率和波长是决定光的颜色和能量的两个重要参数5.3 光的传播速度：光在真空中的传播速度为光速，约为每秒30万公里5.4 光的吸收和透射：光在物质中的传播过程中，有一部分能量被物质吸收，另一部分能量透过物质5.5 原子、分子和离子的能级：原子、分子和离子在能级上存在能量差距5.6 原子、分子和离子的吸收和透射：原子、分子和离子在特定波长的光作用下，会发生吸收或透射5.7 光源和单色器：分光光度计使用特定光源和单色器来产生特定波长的光5.8样品室和探测器：样品室用于容纳待测样品和参比样品，探测器用于测量吸收光强度5.9数据处理和显示：分光光度计将测量到的数据进行数字化处理并显示出来。

分光光度计使用原理及操作方法分光光度计的主要组成部分包括光源、样品室、光栅和光电检测器。

光源发出一束光线，经过光栅的光线会发生衍射，然后进入样品室，样品吸收一部分光线，剩余的经过光电检测器后被转化为电信号。

分光光度计会测量入射光和出射光之间的差异，据此计算溶液的吸光度。

操作分光光度计需要进行以下几个步骤：1.准备工作：打开分光光度计并等待预热，校准仪器，确保其准确度。

通常可以使用空白试剂即不含任何物质的溶液来进行校准。

2. 设置波长：根据实验需求设置所需的波长。

旋转光栅调节按钮或者键盘上的波长调节按钮，使仪器显示所需波长。

常见的波长范围是200-800 nm。

3.放置空白试剂：选择一种透明溶液作为空白试剂，将其转移到样品室中，确保样品室内无气泡和杂质。

关闭样品室。

4.零点调零：选择一个与空白试剂相近的波长，通过调节零点调零旋钮或键盘上的零点调零按钮，使光电检测器的读数为零。

5.测量样品：将需要测量的溶液转移到样品室中，确保样品室内无气泡和杂质。

关闭样品室。

根据实验需求选择适当的波长，并将分光光度计调至该波长。

6.讲样品的吸光度读数：记录分光光度计显示的吸光度读数。

如果需要对样品进行多次测量，可以重复步骤4和57.数据处理：根据实验需求，可以将吸光度读数与标准曲线进行比对，推断样品的浓度或其他信息。

在使用分光光度计时，还需要注意以下几个问题：1.波长选择：根据需要测量的物质的最大吸收波长，选择合适的波长。

在测量吸光度时，应选择吸收峰附近的波长，以提高测量的准确性。

2.样品制备：样品应尽量避免溶解剂或其他杂质的影响，应选择透明度高的溶液。

有时需要对样品进行稀释，使其浓度能够落在标准曲线范围之内。

3.校准和零点调零：在进行实验之前，应该进行仪器的校准和零点调零，以确保测量的准确性。

校准使用空白试剂进行，零点调零使用相近波长进行。

4.注意事项：在使用分光光度计时，样品室的门应完全关闭，以保证光路的稳定性。