肝细胞培养方法

肝细胞代谢稳定性实验流程

## Procedure for Hepatocyte Metabolic Stability Assay.

### Experimental Design:

Materials:

Human hepatocytes.

Test compound.

Incubation medium (e.g., Williams' E medium)。

Internal standard.

Extraction solvents (e.g., methanol, acetonitrile)。

Procedure:

1. Hepatocyte Culture:

Thaw and resuspend hepatocytes in incubation medium.

Seed hepatocytes in 96-well plates or other

appropriate culture vessels.

Incubate hepatocytes overnight to allow attachment.

2. Treatment with Test Compound:

Prepare stock solutions of the test compound in

DMSO or other suitable vehicle.

Add aliquot of test compound solution to the

hepatocyte cultures.

Incubate cultures for a predetermined time (e.g.,

30 minutes to 24 hours).

小鼠肝细胞原代培养+灌注

我把我整理和收集战友的一些资料供你分享：

材料：小鼠

器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器

试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS

准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

操作步骤：

1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。

2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。

3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。

4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。

6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。

8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，现分别介绍如下，首先介绍原代肝细胞的分离。

目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。具体操作步骤如下：

1: 供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术，可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十二指肠后面进行）。分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。追踪肝总动脉的行程，直至脾动脉、胃左动脉显露，结扎离断脾动脉、胃左动脉，显露腹腔动脉干。轻轻抬起肝脏，显露其下的门静脉，将其从周围的淋巴组织中分离出来，注射肝素100U。缝扎胃左静脉以及来自胰腺的第一分支，以获取足够长度的门静脉。在胰腺颈部分别用力行两道结扎，并于结扎线间将其离断，这样就可显露脾静脉与肠系膜上静脉的会合处。将灌注导管插入门静脉，并结扎牢靠，在远心端离断肝上下腔静脉，准备肝脏灌注。迅速切除肝脏，术中连同肝上下腔静脉周围膈肌组织缘一并切除以移动肝脏，最终将肝脏在腹膜后切除，获取肝脏。之后行门静脉插管，准备行肝脏灌注，分离肝细胞。

低浓度胶原酶原位循环灌流法：

1取Wistar大鼠，用2%戊巴比妥钠10mg/100g体重、肝素20 u/100g体重分别腹腔注射以麻醉和抗凝。

2 10-15分钟后固定大鼠，75%酒精消毒，紫外灯照射15-30分钟。腹部再次75%酒精消毒后正中切开打开腹腔并更换器械。

3显露肝门部门静脉并游离2-3cm；显露游离肝下下腔静脉2-3cm，各置一结扎线，暂不结扎。

4穿刺针插入门静脉后立即结扎固定，尽快接通硅胶管并启动蠕动泵（无泵时，输液器亦可），同时剪断肝下下腔静脉远端。

5用D-Hanks液20-30ml/min快速灌注清除肝内血液，1分钟内即可见肝脏颜色变浅，持续灌注10分钟至肝脏呈米黄色。同时切开胸腔结扎肝上下腔静脉。

6插另一硅胶管入肝下下腔静脉并结扎固定，换D-Hanks液为胶原酶消化液(370C预热)循环灌注消化，灌流速度为10-20ml/min，持续时间10-20分钟至肝质变软，压之凹陷不易恢复。

7停止灌注，小心剪取各肝叶置入消毒平皿内，加入适量肝细胞洗涤液（4oC预冷），撕碎肝脏并祛除纤维结缔组织，制成混合肝脏细胞悬液。

8 100目筛网过滤入50ml离心管，500rpm离心1-2分钟。去上清，沉淀加入RPMI 1640 （4oC预冷）20-30ml洗涤3次。

9肝细胞沉淀加入肝细胞培养液重悬为10ml，取适量计数并用0.4%台盼蓝染色判断存活率。后即可按实验设计接种培养.

几点体会与疑问:

1.开始肝素对所研究的实验结果有没有影响.比如你想测一种蛋白,可能肝素本身是一个因素.肝素原因在于抗凝不良致肝内血液淤滞严重影响消化灌注这一问题。因为发现永不用肝素细胞的提取量差不多.

2.第四步的同时剪断肝下下腔静脉远端很重要.

3.输液器的胶原酶消化液的温度控制问题.

4.4oC预冷的肝细胞洗涤液对细胞的功能有没有影响.觉得首先细胞缺氧的可能.所以觉得采取常温行不行?

齐齐哈尔医学院学报２０１４年第３５卷第１期Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＯｉｑｉｈａｒ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１４，Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．１　

一种ＳＤ大鼠肝细胞原代培养的改良方法　

王力　刘辉　

１．摘要】　目的　建立一种改良的大鼠肝细胞原代培养方法。方法　取６到７周龄ＳＤ大鼠（约　

２００ｇ），３％戊巴比妥钠麻醉，采用Ｓｅｇｌｅｎ两步胶原酶灌流法分离肝细胞，Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心纯化肝细胞，　

种植在预先用ｇｅｌａｔｉｎ处理的培养皿内。结果分离所得肝细胞成活率达９５％以上。２４　ｈ后用相差显微　

镜观察细胞贴壁良好，细胞形态规则；４８　ｈ后细胞开始伸展。结论使用改良的方法获得的细胞成活率　

高，贴壁牵，适合常见的药理毒理实验。　

ｌ：关键词】ｓＤ大鼠；肝细胞；原代培养　

Ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｏｆ　ＳＤ　ｒａｔ　ⅣＧ　Ｌｉ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　

Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｎｇｂｕ　ＭｅｄｉｃａＺ　Ｃｏｌｌｅｇｅ。Ｂｅｎｇｂｕ，Ａｎｈｕ　，２３３０３０，　ｉｎａ．　

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｒａｔ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　

ＳＤ　ｍｔ（６—７　ｗｅｅｋｓ　ｏｌｄ，ａｂｏｕｔ　２００ｇ）ｗａｓ　ａｎａｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　３％ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ　ｓｏｄｉｕｍ，ｓｅｇ］ｅｎ　ｔｗｏ—ｓｔｅｐ　

ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｐｅｒｃｏＵ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｃｅｎｔｆｉｆｕｇａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ａｎｄ　ｐｕｒｉ￣　

ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｔｈｅ　ｈａｒｖｅｓｔｅｄ　ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｐｌａｎｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｅｔｒｉ　ｄｉｓｈｅｓ　ｐｒｅ—ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｅｌａｔｉｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ