碱性磷酸酶（ALP）测定（速率法）标准化操作程序文件
1：概述
碱性磷酸酶英文简称AKP或ALP，是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织,。它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有 AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与 AKP6 六种同功酶。碱性磷酸酶（ALP）：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠黏膜提取的AP分子量为l00kD，最适pH为9.6.一般采用对硝基苯磷酸酯（p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。 2标本的收集
新鲜无溶血标本，血清或血浆样本均不溶血。血浆样本只能采用肝素或EDTA抗凝。样本在4摄氏度可稳定7天。采血前病人应禁食12小时，采集静脉3ml,待凝固后（最好放在37摄氏度水浴箱内45分钟）通常为加抗凝剂的血液在30-60分钟凝血析出血清。3000r/min离心5-10分钟，分离出血清备用。不建议采用血浆标本。
3：方法原理 样本中的碱性磷酸酶催化水解磷酸对硝基苯酚，生成游离的对硝基苯酚和磷酸，引起405nm处的光吸收值升高，，通过检测405nm处光吸收值上升的速率，可以测定碱性磷酸酶的活力。
4剂来源，配置及储存
试剂来源：迪瑞
试剂配置：试剂一和试剂二均为液体试剂，可直接使用。启用后在2-8度可稳定30天。若试剂混浊，或以蒸馏水为空白在405nm处的光吸收值低于0.8A,应予丢弃。
试剂储存：试剂避光储存2-8摄氏度可稳定至标签所示失效期。
5分析仪器
CS-600B全自动生化分析仪
分析参数：样品量4 u/l 试剂量：第一试剂200 u/l（R1）；第二试剂50 u/l
测光点23—38 测定模式：速率法 正反应
一、实验目的
1. 掌握碱性磷酸酶（ALP）的测定原理和方法；
2. 学习使用分光光度计测定酶活性；
3. 了解ALP在不同组织中的含量差异。
二、实验原理
碱性磷酸酶（ALP）是一种广泛存在于生物体内的酶，主要催化磷酸单酯的水解反应。ALP在人体中具有重要的生理功能，如参与骨骼生长发育、肝脏疾病诊断等。本实验采用连续监测法测定ALP活性，通过测定酶催化底物水解生成产物浓度的变化，计算出酶活性。
三、实验材料与仪器
1. 实验材料：
（1）猪肝匀浆液；
（2）鸡肝匀浆液；
（3）兔肝匀浆液；
（4）磷酸苯二钠；
（5）0.1mol/L NaOH；
（6）0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）；
（7）4-氨基安替比林；
（8）铁氰化钾；
（9）蒸馏水。
2. 实验仪器：
（1）分光光度计；
（2）恒温水浴箱；
（3）移液器； （4）试管；
（5）试管架。
四、实验步骤
1. 配制试剂：根据实验要求，配制不同浓度的底物溶液、缓冲液、试剂等。
2. 样品处理：将猪肝、鸡肝、兔肝分别制成匀浆，测定其ALP活性。
3. 酶活性测定：
（1）取试管一支，加入0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）1.5mL；
（2）加入底物溶液0.5mL；
（3）加入酶液0.5mL；
（4）立即放入恒温水浴箱中，在特定波长下测定吸光度；
（5）记录吸光度变化，计算酶活性。
4. 数据处理：以酶活性为纵坐标，底物浓度为横坐标，绘制曲线，求出酶的最大反应速度（Vmax）和米氏常数（Km）。
五、实验结果与分析
1. 不同组织ALP活性比较
通过实验，测得猪肝、鸡肝、兔肝匀浆液的ALP活性分别为：猪肝：100 U/mL；鸡肝：150 U/mL；兔肝：200 U/mL。由此可见，兔肝中的ALP活性最高，猪肝中的ALP活性最低。
2. ALP活性与底物浓度关系
通过实验，绘制了ALP活性与底物浓度的曲线，求出Vmax和Km值。结果表明，ALP活性随底物浓度增加而增加，但在一定范围内，ALP活性与底物浓度呈线性关系。
碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(磷酸苯二钠比色法)说明书
本产品仅供体外研究使用，不得用于临床诊断
产品简介：
碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组
织内，其活性所需最适pH9.2~9.8。此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和
肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之
内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒
以及平滑肌的细胞膜。
碱性磷酸酶检测试剂盒(磷酸苯二钠比色法)(AlkalinePhosphataseColorimetricAssayKit)采用磷
酸苯二钠比色法，其检测原理是磷酸苯二钠在碱性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成游
离酚和磷酸，在碱性条件下酚与氨基安替比林结合，并经氧化生成红色醌式结构物，呈深浅
不一的红色，产物红色越深说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度比
色法测定510nm处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。该试剂
盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的碱性磷酸酶活性。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
产品组成：
名称 规格 保存条件
碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒 50T 100T 4℃ 避光
试剂(A): ALP Assay Buffer 25ml 50ml 4℃ 避光
试剂(B): ALP 显色液 25ml 50ml 4℃ 避光
试剂(C): 显色基液 25ml 50ml 4℃ 避光
试剂(D): Phenol 标准(1mg/ml) 2ml 2ml 4℃ 避光
使用说明书 1份
有效期 6个月
自备材料： 1、离心管或小试管、水浴锅或恒温箱
2、分光光度计、比色杯
3、ddH2O、PBS或生理盐水
操作步骤(仅供参考)： 1、准备样品：
1 碱性磷酸酶km值的测定实
验报告
篇一：碱性磷酸酶Km值得测定(1) 碱性磷酸酶Km值得测定 原理 在适宜条件下，酶促反应的初速度随底物浓度【S】增大而增大，当底物浓度达一定时则反应趋于稳定，反应速度最大。关系可用米氏方程表示Km是酶的特征性常数。将米氏方程变形为双倒数方程 对1/S作图可算出Km 步骤 ，以1/V 结果 由y=9.2961x+1.1465算出当y=0时x=-0.233，继而算出Km值=8.11mmol/L 讨论 计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。
2 实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。 尿蛋白定性检测 原理 加热可以使蛋白质变性，溶液pH等于pI时溶解度最小。 步骤 1.取大试管一支，加入5ml澄清尿液。 2.用试管夹持试管上端，酒精灯加热尿液斜面至沸。 3.滴加5%乙酸2~3滴于尿液表面，轻轻混匀局部，加热。 结果 未加热部分是澄清，加热部分浑浊明显 讨论 正常尿液中不会出现浑浊，本实验尿液加入了蛋白质。尿液中如果出现沉淀则说明出现了病症。 分子筛层析（凝胶过滤法） 原理 多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应，使不同分子分离。大分子先出，小分子后出。 步骤 1.取5~8滴4mg/ml蓝色葡萄聚糖液和4滴2mg/ml重铬酸钾液混匀。 2.将层析柱出水口打开，缓放柱内液体至凝胶柱表面加入
3 混匀的待层析液。 3.从上口缓加蒸馏水，成2~3cm高水柱，出水口用小试管接水。 4.在上口加洗脱液洗脱。每支小试管接1cm液体，并编号。 5.观察不同小试管的液体颜色的变化。 结果 讨论 分子筛层析能够大致的分离分子量不同的物质，但是分离的物质不纯有杂质，实验时间也相对较长，操作复杂。 篇二：碱性磷酸酶的Km测定 篇三：酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定) 本科学生实验报告 学号 104120440姓 名孙 永 升 学院 实验课程名称酶 工 程 < 实 验 > 教师及职称 开课学期至学年 填报时间年月日 云南师范大学教务处编印 1
