细胞爬片的方法与心得
- 格式：pdf
- 大小：216.57 KB
- 文档页数：3
细胞爬片的方法与心得
【爬片的准备】
1、爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；
2、应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；
3、将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20
遍，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是冲洗干净就可以了），放在饭
盒或者培养皿（一定是玻璃的哦，要不然就……）中烘干后进行高压消毒。
【培养板的准备】
1、 泡酸过夜
2、 冲洗，烘干（1、2步骤与前大致相同）
3、 放入超净工作台用紫外线照1～2小时就可以用了（在照之前可以将爬
片一并放入，若细胞贴壁能力不强，可经多聚赖氨酸浸片后放入。贴壁能力强的
话，就可以省略了，进行紫外线消毒）
注： 此步自己的经验是爬片可以先浸入消毒后的PBS内，紧接着放入培养板内。目的：浸过PBS的爬片依靠表面的液体，可以用培养板孔底贴和紧密，
以利于细胞长到爬片上。（自己刚开始做的时候，经常就是细胞全都长在了爬片
与培养板之间，爬片上细胞罕见。）
【细胞爬片】
1、 胰酶消化细胞后计数
2、 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可
3、 第二天即可进行干预措施
多聚赖氨酸的浓度要求应该不严格，主要就是将贴壁能力弱的细胞固定上
去，如0.1％（w/)，消毒可用紫外线照射。
园子里搜到的玻片的处理方法：
玻片泡酸，自来水冲洗数遍，去离子水冲洗，就像细胞培养瓶等的那种处理
就可以。然后放在小饭盒或者玻璃皿里高压灭菌。再烤干备用。
将玻片用灭菌镊子放于培养皿中，加细胞。整个过程注意无菌操作就是了。
也没啥难的。 要注意的是：
1.泡过酸的玻片特别脆。用镊子夹着过水。要冲得充分，和那些细胞培养用
玻璃管，瓶等的原则一样。
2.如果你觉得玻璃片太大。可以在泡过酸，水冲洗过用磨石在玻璃片上划痕，
掰开。我曾将一个玻璃片分成4个小片，在12孔，24孔板里放一两片那种。
3.有个问题我一直没有解决好：就是加上培养基后玻璃片拿动培养皿时，玻
璃片会窜，常会压到长在皿底部的细胞。挺麻烦的。后来还发现在玻璃片上的细
胞和长在皿底部的细胞形态有点不一样。现在我已经不做爬片了，直接在皿里做免化等也不错。
爬片的HE染色及注意事项：
要点： 标本的制备：细胞爬片的制作很关键，首先是细胞能够爬好，细胞
分布均匀，密度适中；其次是不会在染色过程中脱片，细胞形态走形！相应的处
理----要选择状态良好的细胞，一般要选择消化吹打均匀传代第二或三天的细
胞，镜下的标准为细胞平铺为瓶底的80％左右为宜。细胞分布均匀，形态良好，
吸取（标准是吸取而不是倾倒）培养基，加无血清培养基或PBS洗一遍，加1ml胰酶（大号瓶可加致2ml），轻晃使胰酶分布到每个角落，考虑胰酶刚刚融化，
加后可在火上过几下，因为在37度消化作用最好。一般消化2到3分钟（不同
细胞不一样，），镜下（金标准）见细胞回缩，边缘折光性改变，向圆形改变（经
验：这时稍用力摇晃，镜下见一些圆形细胞随胰酶漂移即可），即倒掉胰酶，加
培养基或血清（体会：加培养基即可，而且吹打时不易形成泡沫）吹打，感觉象流沙一样最好，但绝对不可消化过头！！消化后要多吹打几次，尽量形成单细胞
悬液，离心后调整细胞接种密度（摸索本细胞系体会：2～5×104/ml合适）。
玻片的制备：盖玻片泡清洁液24小时，自来水洗10遍，1蒸洗3遍，煮沸20分钟，2蒸洗3遍，煮沸20分钟；放入80％（须进一步明确）酒精2～4个小时，用绸布搽拭凉干。放入瓶皿高压灭菌待用。（本实验未用多聚赖氨酸
涂片，具体过程可见DXY）
加细胞时，先在每个孔里滴几滴培养基，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻
片漂起，造成双层细胞贴片。接种后6小时细胞即可贴壁，可去上清加含药培
养基，等作用时间到，取玻片。
固定：细胞爬片后用4％的多聚甲醛固定20分钟后，PBS洗2遍后进行染色；
染色：玻片用中性树胶把无细胞面和载玻片固定，便于染色。过程（此过程
适合细胞爬片，石蜡切片等不尽相同，须查相关文献和专著）——苏木素中1～1.5分钟；自来水洗数遍，加氨水（少量，起泛蓝的作用）；放入分化液（配方
为盐酸酒精，比例未记！作用时间，有文献介绍2～7秒，具体须自己摸索；作
用是溶解蓝色的苏木素，尤其是胞浆的蓝色）片刻；放入伊红1～2分钟；80％酒精2～3分钟；95％酒精Ⅰ2～3分钟；95％酒精Ⅱ5分钟； 100％酒精Ⅰ5
分钟；100％酒精Ⅱ10分钟；二甲苯Ⅰ10分钟；二甲苯Ⅱ10分钟；将玻片细
胞面和载玻片用中性树胶封片。
细胞爬片的保存：
A：只需要用95％酒精或者4％多聚甲醛固定10－15分钟，用吹风机吹干后放在－20℃保存就可以了，而且可以长期放置，以后可以根据实验需要进
行HE染色，免疫组化，细胞化学等染色。
B：对于一般的细胞免疫组化，我的做法是：细胞爬片用冰的纯丙酮固定20MIN，再在通风柜将丙酮吹干，—-20度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白
质和糖，穿透性很强，保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做细胞细胞爬片的
固定剂。
当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。
如：1。多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。 主
要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化
决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等
2．乙醇。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：但醇类对低分子蛋白
质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；
染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度
3．甲醛(福尔马林)应用最广 优点：形态结构保存好，且穿透性强， 缺点：
甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的
网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
关于细胞的打孔：
如果做免疫组化，是否需要打孔应该根据你的抗原所在的位置来决定，如果
是跨膜蛋白，就不需要打孔了，如果是胞内蛋白和核内蛋白则需要打孔，其余步
骤与普通免疫组化一样，但是只需要从蒸馏水开始，而不需要进行脱蜡和酒精下
行的步骤。
别一种打孔方法：可以通过用1%triton X-100或者在洗液中加入0.2%
的triton X-100PBS。补充多聚赖氨酸的涂片：
