中缝核miR-16与5-羟色胺转运体在失眠模型大鼠中的表达

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中缝核miR-16与5-羟色胺转运体在失眠模型大鼠中的表达作者:方芳罗伏钢宋明芬李静刘文娟胡霖霖李梅张永华邵琼琰来源:《中国现代医生》2020年第02期[摘要] 目的研究中縫核miR-16以及5-羟色胺转运体(serotonin transporter,SERT)的表达在失眠症发病机制中的作用。

方法 20只雌性SD大鼠,随机分成对照组和失眠组。

失眠组大鼠接受腹腔注射对氯苯丙氨酸(p-chlorophenalanine,PCPA)350 mg/(kg·d),连续3 d,对照组给予等量生理盐水。

取中缝核组织,测定其miR-16、SERT mRNA与SERT蛋白水平,进行注射前后的组间比较。

结果失眠组大鼠中缝核miR-16相对水平(1.23±0.33)与对照组(0.71±0.25)比较明显升高,差异具有统计学意义(t=6.68,P=0.000);而失眠组SERT mRNA 相对水平(0.68±0.14)以及SERT蛋白相对水平(0.28±0.11)显著低于相应的对照组(1.06±0.30,0.57±0.15)(t=3.94,P=0.004;t=4.69,P=0.002)。

结论中缝核miR-16以及SERT的异常表达,可能参与了失眠症的发病机制。

[关键词] 失眠;miR-16;5-羟色胺转运体;中缝核[中图分类号] R74; ; ; ; ; [文献标识码] A; ; ; ; ; [文章编号] 1673-9701(2020)02-0034-04Expression of raphe nuclei miR-16 and serotonin transporter in insomnia model ratsFANG Fang1; ;LUO Fugang2; ;SONG Mingfen3; ;LI Jing3; ;LIU Wenjuan4; ;HU Linlin4; ;LI Mei4; ;ZHANG Yonghua4; ;SHAO Qiongyan51.Emergency Room, Hangzhou Seventh People's Hospital, Hangzhou; ;310013, China;2.Department of Geriatrics, Hangzhou Seventh People's Hospital, Hangzhou; ;310013, China;3.Molecular Biology Laboratory, Hangzhou Seventh People's Hospital, Hangzhou 310013,China;4.Department of Psychophysiology, Hangzhou Seventh People's Hospital,Hangzhou; ;310013, China; 5.Third Clinical College, Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou; 310053, China[Abstract] Objective To study the role of raphe nuclei miR-16 and serotonin transporter (SERT) expression in the pathogenesis of insomnia. Methods Twenty female Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group and insomnia group. Rats in the insomnia group received intraperitoneal injection of p-chlorophenalanine(PCPA) 350 mg/(kg·d) for 3 days, and the control group was given the same amount of saline. The raphe nuclei tissue was taken and the levels of miR-16, SERT mRNA and SERT protein were measured, and the comparison between groups before and after injection was performed. Results The relative level of miR-16 in the raphe nuclei (1.23±0.33) of the insomnia group was significantly higher than that in the control group(0.71±0.25). The difference was statistically significant(t=6.68, P=0.000). The relative levels of SERT mRNA (0.68±0.14) and SERT protein (0.28±0.11) in insomnia group were significantly lower than those(1.06±0.30, 0.57±0.15) of the corresponding control group(t=3.94, P=0.004; t=4.69, P=0.002). Conclusion Abnormal expression of miR-16 and SERT in the raphe nuclei may be involved in the pathogenesis of insomnia.[Key words] Insomnia; miR-16; Serotonin transporter; Raphe当今社会失眠发病率不断攀升,据报道失眠的发病率高达10%[1,2],已成为危害身心健康的社会公共卫生问题[3]。

但是失眠的发病机制未明。

现有研究提示,失眠的发病机制与5-羟色胺(5-HT)系统功能低下有关[4,5]。

5-羟色胺转运体(serotonin transporter,SERT)分布于神经突触前膜,从突触间隙中回收5-HT,起到调节突触间隙5-HT浓度的作用,决定与突触后受体结合的5-HT量和作用持续时间,在5-HT神经传递系统中起关键作用[6]。

目前研究表明,SERT基因是miR-16的靶基因[7-9]。

但是失眠症miR-16及其靶基因SERT的表达水平尚不清楚。

本次实验建立对氯苯丙氨酸(p-chlorophenalanine,PCPA)大鼠失眠模型,检测中缝核miR-16与SERT水平,探讨miR-16及其靶基因SERT的表达在失眠症发病机制中的作用,为进一步了解失眠症的5-HT机制提供参考。

1 对象与方法1.1 研究对象清洁级健康雌性Sprague Dawley(SD)大鼠,购自浙江省医学科学院实验动物中心,动物合格证号:SCXK(浙)2014-0001,8周龄,体重约250 g。

饲养室温度控制在(25±1)℃,相对湿度为(55±5)%,12 h/12 h明暗交替照明,自由饮水和摄食。

实验前适应性饲养1周。

1.2 方法1.2.1 动物处理; 20只SD大鼠按随机数字表法分成对照组和失眠组。

大鼠失眠模型的建立参照以往的研究进行[10]。

PCPA(购自美国Sigma公司),用生理盐水制成混悬液,现用现配。

失眠组大鼠腹腔注射PCPA剂量为350 mg/kg,体积为10 mL/kg,1次/d,连续3 d。

对照组大鼠腹腔注射等量的生理盐水。

1.2.2 大鼠一般状况观察; 观察两组大鼠一般状况,包括精神状态、对应激的反应情况、毛发情况、日间与夜晚活动情况等。

1.2.3 造模成功的判断; 采用戊巴比妥钠翻正实验判断。

在第3次注射后36 h,两组大鼠均腹腔注射戊巴比妥钠(购自美国Sigma公司)50 mg/kg(引起所有大鼠睡眠的最小域剂量),将大鼠腹部朝上平放,以翻正反射消失为发生睡眠,以翻正反射恢复为觉醒[10],记录大鼠的睡眠潜伏期及睡眠持续时间。

若大鼠白天与夜晚都频繁活动,且戊巴比妥钠翻正实验中对照与失眠组的睡眠潜伏期、睡眠持续时间比较有统计学差异,则造模成功。

1.2.4 中缝核取材; 戊巴比妥钠翻正实验结束后,断头处死大鼠,剪开颅骨,分离脑组织置于冰上,从脑干中切取中缝核,-80℃冷冻待测miR-16、SERT mRNA和SERT蛋白。

1.2.5 实时荧光定量PCR法测定miR-16; 通过总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取中缝核总RNA,用Nanodrop(美国thermo scientific公司)测定浓度和纯度;取2 μg总RNA用cDNA第一链合成试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]反转录成cDNA,然后进行实时定量荧光PCR扩增测定miR-16水平,miRNAs荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)购自天根生化科技(北京)有限公司。

miR-16正向引物:5'-TAGCAGCACGTAAATTGGCG-3'。

反向引物从miRNAs荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)中获得,序列未显示。

PCR扩增程序为:94℃ 2min预变性;然后94℃ 20s,52℃ 30s,72℃30s,循環35次。

荧光PCR仪购自ABI公司,型号Stepone Plus,获得Ct值,并根据内参U6计算miR-16的相对含量。

1.2.6 实时荧光定量PCR法测定中缝核SERT mRNA水平; 上述获得的cDNA采用SYBR Green法测定SERT mRNA水平,荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)购自大连TaKaRa公司,步骤按照说明书进行。

使用β-actin作为内参,得出大鼠中缝核组织中SERT mRNA的相对表达水平。

1.2.7 Western blot法测定SERT蛋白; 使用总蛋白提取试剂盒(碧云天生物技术公司)提取中缝核组织的总蛋白,并且通过BCA法(碧云天生物技术公司)对蛋白进行定量。

SERT抗体以及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自Santa Cruz公司。

使用ChemiDocTM XRS+分子成像仪(美国Bio-rad公司)进行蛋白条带分析,并用内参β-actin校正,得出相对SERT蛋白的相对水平。