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β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-GA）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法：UPLC-MS-4216：50T/24S试剂名称规格保存条件提取液液体50mL×1瓶2-8℃保存试剂一粉剂×2支2-8℃保存试剂二液体42mL×1瓶2-8℃保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1.试剂一：临用前取1支加1.6mL蒸馏水溶解，用不完的试剂2-8℃保存4周；2.标准品：10mg无水葡萄糖。
临用前加入1mL蒸馏水溶解，配制成10mg/mL葡萄糖溶液备用，2-8℃保存2周。
β-1,3-GA(EC3.2.1.73)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。
在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。
β-1,3-GA水解昆布多糖，内切β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端，通过测定还原糖生成速率，来计算其酶活性。
Fucoidanβ-1,3-GA Reducing SugarReducing Sugar+3,5-Dinitrosalicylic Acid3-Amino-5-Nitrosalicylate（540nm）注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、超声破碎仪、冰和蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
12000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.细菌或细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200w超声3s，间隔10s，重复30次）；12000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
β-葡聚糖酶活性测定β-葡聚糖是由葡萄糖单体通过β-1，3和β-1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于单子叶禾本科谷实中的糊粉层和胚乳细胞壁中。
β-葡聚糖酶属于水解酶类，能有效地降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷键，使之降解为小分子。
由于在饲料中，大麦的β-葡聚糖含量较高，难以被单胃动物消化利用，而且对饲料中各种养分的消化利用具有明显的干扰和抑制作用，成为麦类饲料中的抗营养因子。
在饲料中添加β-葡聚糖酶，能有效地消除β-葡聚糖的抗营养作用，促进饲料中各种养分的消化和吸收利用，增进畜禽健康。
在啤酒生产中，添加β-葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒的过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖的含量。
此外，β-葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛的应用，对β-葡聚糖酶的研究将越来越受到人们的重视。
β-葡聚糖酶活力的测定方法主要有3种：还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法。
其中还原糖测定法简便实用，比较准确，而且结果重复性好，是广泛使用的一种酶活测定方法。
其原理是：β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色的深浅与还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以利用比色测定反应液的吸光度值来计算还原糖的生成量，从而得出β-葡聚糖酶的活力。
但在该测定方法的具体操作中存在一些影响酶活力测定结果的因素，本文即对还原糖法测定β-葡聚糖酶活力的几个重要影响因素进行研究，并得出最佳测定条件。
1 材料与方法1.1 菌株与培养基1.1.1 发酵产酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）A47菌株，由本实验室保藏。
1.1.2 固态发酵培养基麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3 2.95 g、微量元素液0.05 ml、蒸馏水100ml，pH值5.0，121 ℃灭菌20 min。
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(4):708~712*基金项目： 国家自然科学基金 （No.20276064） 资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.教授， 博导， 主要从事食品微生物相关的研究。
Email:<gqhe@>. 收稿日期：20061225 接受日期： 20070316 ·研究论文· 基因工程菌 产 茁 葡聚糖酶条件优化及产酶特性 *李青青 1 , 陈启和 1 , 蒋孝燕 1, 张秀艳 2 , 李 婷 1 , 何国庆 1 ** (1.浙江大学食品科学与营养系， 杭州 310029； 2.华中农业大学食品安全与微生物学系， 武汉 430070)摘要： 用乳清粉作为主要培养基组成， 采用正交试验对大肠杆菌 （ ） 重组菌 的发酵条件进行了优化，并 对粗酶液的酶学性质进行了研究。
重组菌 的最佳发酵条件为： 摇床转速 170r/min ， 接种量 1%， 发酵培养基初始 pH 6.0，种龄12h 。
重组菌茁 葡聚糖酶的表达与菌体生长呈正相关， 发酵 14h 后， 菌体生物量最高可达1.71g/L ， 茁 葡聚糖酶活力最高可达 321.56U/mL 。
所得粗酶液的最适反应温度 60 ℃,pH 6.0， 在 70 ℃以下保温20min 后， 残余酶活力均在 80%以上。
在pH 5.0～9.0放置48h 后仍能保持均90%以上的残余酶活力。
关键词： 茁 葡聚糖酶；重组菌 EGs2； 发酵条件； 酶学性质 中图分类号: S182 文献标识码:A 文章编号:10061304(2007)04070805Optimization of Recombinant Fermentation ConditionAffecting 茁glucanase Production and Its Characteristics of Enzyme LI Qingqing 1 ,CHEN Qihe 1 ,JIANG Xiaoyan 1 ,ZHANG Xiuyan 2 ,LI Ting 1 ,HE Guoqing 1**The fermentation conditions of mutant obtained from directed evolution for thermostable 茁glucanase for 茁glucanase production were investigated by orthogonal experiment.Fermentation was conducted in 250mL flask,each containing 30mL of medium contained whey 10g/L,yeast extract 5g/L,NaCl 10g/L,the temperature was 37 ℃.The optima culture conditions were as following:initial pH 6.0,shaking speed 170r/min,inoculation volume 1%and inoculation time 12h. 茁 glucanase production by mutantwas associated with cell growth and biomass. 茁glucanase activity was increased significantly when cells entered growth phase.The bacterium began the stable phase after cultured for 14h with the highest biomass 1.71g/L and 茁glucanase activity 321.56U/mL.When 茁 glucanase was used as a substrate,the optimum temperature and pH were 60 ℃ and 6.0,respectively. After 20min incubation at 40,50,55,60,65and 70 ℃ respectively,the residual activity remained at least 80%.After 48h conserva tion at pH 5.0~9.0,the residual activity remained at least 90%.The enzyme was stable below 70 ℃ and at pH 5.0~9.0.茁glucanase;mutant ;fermentation condition;enzyme characteristic茁1,31,4 葡聚糖酶是重要的工业用酶。
《生防萎缩芽孢杆菌β-l,3-葡聚糖酶拮抗功能的研究》篇一摘要本文旨在探讨生防萎缩芽孢杆菌所产β-l,3-葡聚糖酶的拮抗功能。
通过对该酶的生物特性、作用机制及与病原菌的互作关系进行深入研究，揭示其在生物防治中的潜在应用价值。
本研究不仅为农业病害的生物防治提供了新的思路，也为微生物酶在生态修复和环境治理中的广泛应用奠定了理论基础。
一、引言生防萎缩芽孢杆菌作为一种常见的生防微生物，在农业生产中具有广泛的应用前景。
其中，β-l,3-葡聚糖酶作为该菌的重要代谢产物，对于病原菌的抑制作用引起了研究者的极大兴趣。
本文将重点探讨该酶的拮抗功能及其作用机制，以期为农业病害的生物防治提供新的策略。
二、材料与方法1. 材料准备（1）菌种来源：生防萎缩芽孢杆菌及其相关病原菌；（2）培养基：选用适合菌种生长的各类培养基；（3）酶提取与纯化：按照标准操作流程提取纯化β-l,3-葡聚糖酶。
2. 方法（1）酶活性测定：采用适当的方法测定β-l,3-葡聚糖酶的活性；（2）互作实验：通过共培养实验、酶处理实验等方法，观察生防萎缩芽孢杆菌与病原菌的互作关系；（3）基因表达分析：利用分子生物学技术，分析β-l,3-葡聚糖酶相关基因的表达情况；（4）数据分析：采用统计学方法对实验数据进行处理和分析。
三、结果与分析1. 酶的生物特性及活性分析本研究提取的β-l,3-葡聚糖酶具有较高的活性，能够在较低的浓度下显著抑制病原菌的生长。
通过测定酶活性，发现其活性随温度和pH值的变化呈现一定的规律性。
2. 拮抗功能及作用机制（1）生防萎缩芽孢杆菌与病原菌的互作：共培养实验表明，生防萎缩芽孢杆菌能够通过产生β-l,3-葡聚糖酶抑制病原菌的生长和繁殖。
此外，该酶还能破坏病原菌的细胞壁，导致其失去生理活性。
（2）酶处理实验：通过将病原菌暴露于不同浓度的β-l,3-葡聚糖酶中，发现酶的浓度越高，对病原菌的抑制作用越明显。
进一步分析表明，该酶主要通过降解病原菌细胞壁中的葡聚糖成分，破坏其结构，从而达到抑制生长的目的。
一、实验目的1. 了解葡聚糖酶的特性和作用机理。
2. 掌握葡聚糖酶活性测定的方法。
3. 通过实验验证不同条件下葡聚糖酶活性的变化。
二、实验原理葡聚糖酶（Glycosidase）是一种水解酶，能特异性地催化葡聚糖分子中葡萄糖单元之间的β-1,4-糖苷键的水解反应。
在实验中，通过测定在一定时间内，葡聚糖酶催化水解一定量的葡聚糖所生成的还原糖量，来计算葡聚糖酶的活性。
三、实验材料1. 葡聚糖酶（Glycosidase）2. 葡聚糖（Dextran）3. 还原性糖测定试剂4. 移液器5. 恒温水浴锅6. 试管7. 离心机8. 分光光度计四、实验方法1. 标准曲线绘制：将已知浓度的还原性糖溶液，在特定波长下进行比色测定，绘制标准曲线。
2. 葡聚糖酶活性测定：a. 准备一定浓度的葡聚糖溶液；b. 将葡聚糖溶液和一定量的葡聚糖酶混合，置于恒温水浴锅中；c. 在一定时间间隔内，取出一定体积的混合液，加入终止剂，终止反应；d. 用分光光度计测定混合液的吸光度；e. 根据标准曲线计算还原糖量；f. 计算葡聚糖酶的活性。
3. 不同条件下葡聚糖酶活性测定：a. 调整实验温度、pH值、酶浓度等条件；b. 重复上述实验步骤，测定不同条件下的葡聚糖酶活性。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：绘制标准曲线，线性范围为0.2-1.0 mg/mL。
2. 葡聚糖酶活性测定：a. 在30℃、pH 6.0条件下，测定葡聚糖酶活性为10 U/mL；b. 在50℃、pH 7.0条件下，测定葡聚糖酶活性为15 U/mL；c. 在30℃、pH 5.0条件下，测定葡聚糖酶活性为5 U/mL。
3. 不同条件下葡聚糖酶活性测定：a. 在30℃、pH 6.0条件下，调整酶浓度为5 U/mL，测定活性为8 U/mL；b. 在50℃、pH 7.0条件下，调整酶浓度为10 U/mL，测定活性为12 U/mL；c. 在30℃、pH 5.0条件下，调整酶浓度为10 U/mL，测定活性为4 U/mL。
配合饲料中β-葡聚糖酶酶的加工及检测由于β-葡聚糖酶制剂的商品化生产，使得大麦可作为饲料原料添加到家禽日粮中，并且不会因高β-葡聚糖水平而降低家禽的生产性能及产生粘性粪便（Campbell和Bedford，1992）。
目前，β-葡聚糖酶已广泛用于世界大麦产区。
不过，有关热处理对添加到饲料中β-葡聚糖酶影响的研究报道仍然有限。
Eeckhout 等（1995）对在50～95摄氏度下调质和在72～91摄氏度下制粒的商品仔猪料中的β-葡聚糖酶活性进行了测定。
结果表明，即使在最低温度下，饲料中的β-葡聚糖酶活性在加工后亦丧失40%，而在最高温度下，仅保存7%的活性，并且2/3的活性是在调质期间丧失的。
另一方面，Esteve-Garcia等（1997）发现，添加到肉仔鸡料中的β-葡聚糖酶经过接近80摄氏度的调质与制粒温度仍能保留大部分的活性。
其所使用的酶被制成微细颗粒。
这表明，β-葡聚糖酶可以稳定的形态添加到饲料中。
至少有2个试验对肉用雏鸡在饲喂经热处理的酶补充日粮后的生产性能进行了测定。
McCracken等（1993）在大麦基础日粮中添加了一种稳定形态的商品酶混合物，其中含有β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性，日粮在制粒前于85摄氏度温度下加热15分钟。
结果表明，日粮在未补充外源性酶的情况下进行热处理，使饲料营养物质的表观消化率降低、肉用雏鸡肠道内容物的粘度增加及粪便干物质含量减少；但在补充外源性酶的情况下进行热处理，则提高了饲料营养物质的消化率，并消除了热处理引起的不利效应。
这充分说明，酶在85摄氏度温度下仍保持活性。
Vukic-Vranjes等（1994）测定了两种日粮中添加商品酶混合物的效应，其中一种日粮含有20%的大麦。
该酶混合物含有β-葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶和果胶酶活性。
这两种日粮在70～75摄氏度下调质，在110～120摄氏度下制粒或挤压膨化。
与制粒相比，挤压膨化对雏鸡生产性能产生不利影响。
同时，挤压膨化还使饲料的体外粘度增加，这表明高温使饲料中非淀粉类多糖的溶解度增加。
β-葡聚糖酶活力测定方法(NY/T911-2004)∙ 1.原理β-葡聚糖酶能将木聚糖降解成还原性糖。
还原性糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸（DNS)试剂反应显色反应。
反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。
∙ 2. 操作∙ 2.1.标准葡萄糖曲线的制作2.1.1 吸取PH5.5的0.1M乙酸-乙酸钠+缓冲溶液4.0mL,加入DNS试剂5.0mL，沸水浴加热5min。
用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL,制成标准空白样。
2.1.2 分别吸取葡萄糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL,分别用PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液定容至100mL,配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg、0.60mg/mL和0.70mg/mL葡萄糖标准溶液。
2.1.3 分别取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0mL缓冲液94.4)和5.0mLDNS试剂。
电磁振荡3s-5s,沸水浴加热5min。
然后用自来水冷却到室温，在用水定溶液至25mL。
以标准空白为对照调零，在540min处测定吸光度A值。
以葡萄糖糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。
每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线∙ 3. 酶样测定吸取10.0mLβ-葡聚糖溶液,37℃平衡20min。
吸取10.0经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。
∙吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mLDNS试剂，电磁振荡3s-5s。
然后加入8.0g/lβ-葡聚糖溶液2.0ml，37℃保温30min,沸水浴加热5min。
β-1,3-葡聚糖含量测定方法
β-1,3-葡聚糖（也称为1,3-β-D-葡聚糖或胞外多糖）是一种可溶性聚糖，常用于农业、食品和医药工业。
测定β-1,3-葡聚糖的含量可以通过以下方法之一实现：
1. 紫外可见光谱测定：将葡聚糖溶液经稀酸或酶处理后，通过
测定其在特定波长下的吸收光强度来确定其浓度。
这种方法对于测定
高浓度的β-1,3-葡聚糖样品较为简便。
2. 蒸发法：将葡聚糖溶液加热至葡聚糖变为糊状物，并将其继
续加热蒸发至干燥。
然后称量得到的干燥物的质量，通过质量差来计
算葡聚糖的含量。
这种方法对于测定低浓度的β-1,3-葡聚糖样品较为适用。
3. 原子吸收光谱法：通过将葡聚糖溶解后，在特定条件下使用
原子吸收光谱仪测定其特定金属离子沉淀物的质量，从而计算出含量。
这种方法对于含有特定金属离子的葡聚糖样品测定较为准确。
植物β－1，3－葡聚糖酶的研究进展β-1,3-葡聚糖酶参与了植物的多种生长发育过程，包括细胞分裂、小孢子发生、花粉萌发、育性、韧皮部胼胝质去除、受精、种子萌芽及植物生长调控等过程。
20世纪70年代以前，对β-1,3-葡聚糖酶的研究主要集中于它对植物本身不同发育阶段的作用，随着分子生物学技术在植物抗病基因工程中的逐步应用，β-1,3-葡聚糖酶基因的抗病研究取得了快速发展。
目前，β-1,3-葡聚糖酶基因在植物抗病基因工程研究中已被认为是最具吸引力的基因之一。
1 β-1,3-葡聚糖酶基本生物学特性和分类已知的β-1,3-葡聚糖酶均属于糖基水解酶第十七家族，其成员具有共同的氨基酸序列结构：(LIVM)一x一(LIVM-FVW)3一(STAG)-E-(ST)-G- W-P-(Srr)-X-G．(Lan等，1998)，β-1,3-葡聚糖酶分为外切酶和内切酶，目前主要研究的是内切酶。
它的分子量为32-37kD，等电点从酸性到碱性。
它的作用底物为以β-1,3-苷键连接起来的多聚糖，以随机作用方式将多聚糖分解成为糊精或寡聚糖。
各种类型的β-1,3-葡聚糖酶已从多种植物中分离出来。
根据其等电点、定位、mRNA表达模式及序列的同源性等特点可将其分为四种不同类型。
I类葡聚糖酶为碱性，主要存在于液泡中，体外具较强抑菌活性。
碱性β-1,3-葡聚糖酶通常具有1个液泡定位的羧基末端多肽(carboxyl terminal polypetide，CTPP)结构，CTPP中往往含有糖基化位点即CTPP切除信号氨基酸结构， CTPP的缺乏使得β-l,3-葡聚糖酶分泌到胞外，因此，CTPP存在与否成为β-1,3-葡聚糖酶分类的重要依据。
现已分离出三种编码I类葡聚糖酶的cDNA，它的前体蛋白含有N一端信号肽及C一端液泡导向肽序列。
在根及老叶中组成型表达．占可溶性蛋白的5％-10％，且主要分布在叶的表皮细胞层中。
受病源菌、乙烯、水杨酸、伤口、UV等因素诱导，但被auxin ／cytokine所抑制，并受发育的调节。
ß-葡聚糖含量的测定一、原理刚果红与ß-葡聚糖形成有色物质，当反应条件（如pH、缓冲液离子强度、刚果红试剂浓度）一定时，在ß-葡聚糖溶液中ß-葡聚糖含量的增加而增加，符合比尔定律。
二、试验材料1、仪器721分光光度计、恒温水浴锅、pH计。
2、试剂及溶液配制（1）ß-葡聚糖标样备用液：称取ß-葡聚糖0.005g，先用少量无水乙醇湿润后转移到50mL容量瓶中，再加入少量蒸馏水于70℃水浴中助溶，冷却后定容至50mL，摇匀备用。
（2）0.1MpH8.0磷酸缓冲液A液：称取 Na2HPO4.H20 14.196克溶解于蒸馏水中并定容至1升。
B液：称取 NaH2PO4.H20 1.560克溶解于蒸馏水中并定容至100毫升。
用B液调节A液至pH8.0。
（3）100mg/L刚果红溶液：称取100mg刚果红溶解至1000mLpH8.0磷酸缓冲液中。
三、测定步骤1、ß-葡聚糖标准曲线的绘制上述各试管中依次加4.0毫升刚果红（加入时开始准确计时），于20℃水浴中准确反应10分钟，550nm比色，以0号管中的液体作空白调零测吸光度A，以ß-葡聚糖浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，在曲线上求吸光度为1时相当的ß-葡聚糖微克数（即K值）。
2、样品的制备及稀释普通麦汁：稀释10倍或20倍待测。
协定麦汁：稀释10倍或20倍待测。
啤酒：稀释10倍或20倍待测。
3、样品的测定将稀释好的样品各2.0毫升分别加入4.0毫升刚果红准确计时，20℃水浴中准确反应10分钟，以2.0毫升蒸馏水代替样品作空白调零，测反应液的吸光度A。
4、计算样品的ß-葡聚糖（mg/L）=(K/2)×吸光度A×稀释倍数n5.麦芽样品的测定按协定法制得协定麦汁，测麦汁的ß-葡聚糖含量X（mg/100mL），再根据麦芽的水份W、麦汁浸出物含量G、麦汁比重D计算麦芽的ß-葡聚糖的含量。
饲用酶制剂的酶活检测方法及评定随着我国畜牧业的发展和生物工程技术的不断进步，酶制剂在饲料工业中的应用越来越多。
由于酶制剂能够消除饲料中的某些抗营养因子的负面作用，提高饲料消化率，改善动物生产性能，降低生产成本，因此日益受到饲料界的重视。
但是，由于酶制剂来源比较复杂、分子结构不明确，分离提纯困难等多种原因，使这类产品有国家标准的不多，即使有国标也存在一些问题。
给广大养殖用户和生产企业带来很大不便。
本文简单介绍一下常用的酶活测定方法及测定过程的影响因素，仅供广大饲料工作者提供参考。
1 酶制剂的定义及分类所谓的酶制剂就是通过产酶微生物发酵工程或含酶的动、植物组织提取技术生产加工而成，具有一种或多种底物清楚的酶催化活性，有助于改善动物对饲料营养成分的消化、吸收等，并有功效的生物学评定依据，符合安全性要求，作饲料添加剂用的酶制剂产品（NY/T 722-2003）。
工业上应用的酶制剂大多为水解酶，按作用底物的不同，可分为淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。
按动物体内是否分泌，分为消化酶和非消化酶两大类。
消化酶指动物自身能够分泌的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，在幼龄动物或特殊生理阶段时，动物也存在消化酶分泌不足需要外源供给的情况。
非消化酶是指动物自身不能够分泌或很少分泌，必须由外源供给的酶，这类酶能消化动物自身不能消化的物质或降解一些抗营养因子，主要有植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。
2 常见的酶活测定方法通常酶制剂活性的检测是采用实验室分析手段来进行评价，它可以用来筛选优质酶制剂、确定复合酶制剂的最佳组方及确定产品的最佳添加量等，酶制剂实验室评价技术是目前饲料厂家应用最为广泛的一种方法。
其操作相对简单，检测所用时间短，便于生产实践应用。
酶活测定结果虽不能完全反映酶的使用效果，但通过检测至少可以避免使用劣质的酶制剂。
我国饲料工业标准中已经确立了饲用植酸酶（GB/T 18634）、纤维素酶（NY/T912）、β—葡聚糖酶（NY/T 911）的测定方法。
前 言本标准与Novozymes A/S标准方法：EB-SM-0572.02/02 FBG. Fungal Beta-Glucanase activity by Konelab analyzer(英文版)的一致性程度为等同。
附录A为规范性附录。
本标准由诺维信（中国）生物技术有限公司提出。
本标准由诺维信（中国）生物技术有限公司负责起草。
本标准主要起草人：蔺继尚、关越、翟文景。
本标准于2004年04月首次发布。
诺维信分析方法第112部分：用Konelab分析真菌β-葡聚糖酶活力，FBG1 范围本方法规定了使用Konelab分析真菌β-葡聚糖酶活力的步骤。
本方法适用于所有Novozymes内部分析真菌β-葡聚糖酶样品的实验室。
2 原理β-葡聚糖酶能水解β-葡聚糖，生成还原糖。
该反应通过加入含有PAHBAH和铋盐（Bi3+）的碱性溶液中止。
含有的PAHBAH和铋盐能与还原糖形成有颜色的混合物，在405nm下检测。
生成的颜色与β-葡聚糖酶活力成比例。
该过程由Konelan分析仪自动完成。
2.1 反应条件(反应体系中)酶反应β-葡聚糖浓度： 0.50%β-葡聚糖酶浓度： （1-5）FBG/L缓冲液： 28 mM磷酸缓冲液pH： 5.0温度: 50℃时间: 20 min酶空白反应β-葡聚糖浓度： 0.50%β-葡聚糖酶浓度： （1-5）FBG/L缓冲液： 28 mM磷酸缓冲液pH： 5.0温度: 50℃时间: 20 min显色反应PAHBAH浓度： 42 mM酒石酸盐浓度： 56 mM铋盐浓度： 4.5 mMNaOH浓度： 146 mMpH： 碱性温度: 50℃时间: 20 min测定波长： 405 nm2.2 样品条件(样品溶液中)工作范围： （6-30）FBG/LQ/12KF 3568.112-2004定量范围： （13-30）FBG/L3 单位定义1 FBG等于在给定条件下每分钟生成相当于1µmol葡萄糖的还原糖所需的酶的量。
货号：QS2611 规格：50管/24样β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，β-1,3-GA）试剂盒说明书可见分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：β-1,3-GA(EC 3.2.1.73)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。
在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。
测定原理：β-1,3-GA水解昆布多糖，内切β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端，通过测定还原糖生成速率来计算其酶活性。
自备实验用品及仪器：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存；试剂二：液体30mL×1瓶，4℃保存；粗酶液提取：1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。
12000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。
A，第1页，共2页如果吸光值大于2，可以用蒸馏水稀释后测定（计算公式乘以相应稀释倍数），ΔA=A测定-A 对照。
每个测定管需设一个对照管。
β-1,3-GA活性计算：1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0958x -0.0192；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。
β-1，3-葡聚糖酶活性的测定在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1，3-葡聚糖酶。
该酶水解昆布多糖，内切β-1，3-葡萄糖苷键，产生还原末端。
可通过测定还原糖表示酶活力。
1.仪器设备恒温水浴、分光光度计、研钵、高速冷冻离心机、透析袋等。
2.操作方法1)试剂配制①铜试剂：称取12g酒石酸钾钠（NaKC4H4O3·4H2O），24g无水碳酸钠，16g碳酸氢钠，分别溶于200ml蒸馏水中后混匀。
另称硫酸铜4g（CuSO4·5H2O）溶于200ml蒸馏水，缓缓加入并搅拌到上述混合液中。
再称取无水硫酸钠180g，溶于其中，置沸水浴20min，冷却后过滤，最后定容至1000ml备用。
此液易出现结晶，应保存在20℃以上。
②砷钼酸试剂：25g钼酸铵[（NH4）6Mo7O24·4H2O]溶于450ml蒸馏水，加入22ml浓H2SO4，充分混匀。
另称取3g砷酸氢二钠（Na2HAsO4·7H2O），溶于25ml蒸馏水后，与上述钼酸铵溶液混合，37℃保温24~48h，贮于棕色瓶备用。
2）标准还原糖测定：将500μg/ml的葡萄糖溶液准确稀释至150μg/ml，用此再稀释成数种不同浓度的葡萄糖溶液。
然后取几支干净试管，分别加入不同浓度的葡萄糖溶液0.5ml，并加0.5ml铜试剂，置沸水浴10min后，自来水冷却。
加入0.5ml砷钼酸试剂，混匀，再加入3.5ml蒸馏水，于分光光度计660nm处测定光密度，并作光密度-还原糖浓度标准曲线。
3）酶蛋白的提取和活力测定①酶蛋白的提取：将植物材料加5倍量0.05mol/L的乙酸钠缓冲液（pH5.0），充分研磨，于15000×g 离心15min后，将上清液置透析袋中，用提取液在4℃下透析过夜。
经离心取上清液，放于冰箱备用。
②酶活力的测定：取0.4ml的1mg/ml昆布多糖（Sigma公司，溶于上述乙酸缓冲液），加入0.1 ml酶液，于37℃保温15min，立即加入0.5ml铜试剂，混匀，并于100℃水浴10min，置冷水中冷却，再加入0.5ml砷钼酸试剂，呈现蓝色后加蒸馏水3.5ml，660nm处比色，对照标准曲线求出样品液中的还原糖量。
β-葡聚糖酶活性测定β-葡聚糖是由葡萄糖单体通过β-1，3和β-1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于单子叶禾本科谷实中的糊粉层和胚乳细胞壁中。
β-葡聚糖酶属于水解酶类，能有效地降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷键，使之降解为小分子。
由于在饲料中，大麦的β-葡聚糖含量较高，难以被单胃动物消化利用，而且对饲料中各种养分的消化利用具有明显的干扰和抑制作用，成为麦类饲料中的抗营养因子。
在饲料中添加β-葡聚糖酶，能有效地消除β-葡聚糖的抗营养作用，促进饲料中各种养分的消化和吸收利用，增进畜禽健康。
在啤酒生产中，添加β-葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒的过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖的含量。
此外，β-葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛的应用，对β-葡聚糖酶的研究将越来越受到人们的重视。
β-葡聚糖酶活力的测定方法主要有3种：还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法。
其中还原糖测定法简便实用，比较准确，而且结果重复性好，是广泛使用的一种酶活测定方法。
其原理是：β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色的深浅与还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以利用比色测定反应液的吸光度值来计算还原糖的生成量，从而得出β-葡聚糖酶的活力。
但在该测定方法的具体操作中存在一些影响酶活力测定结果的因素，本文即对还原糖法测定β-葡聚糖酶活力的几个重要影响因素进行研究，并得出最佳测定条件。
1 材料与方法1.1 菌株与培养基1.1.1 发酵产酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）A47菌株，由本实验室保藏。
1.1.2 固态发酵培养基麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3 2.95 g、微量元素液0.05 ml、蒸馏水100 ml，pH值5.0，121 ℃灭菌20 min。
微量元素液的组成为：2 mol/l HCl溶液 5 ml、FeSO4 2.5 g、MnSO4·H2O 0.98 g、ZnCl2 0.83 g、CoCl2 1.0 g、蒸馏水100 ml。
1.1.3 发酵培养条件250 ml三角瓶装10 g培养基（干料计），接种量为每瓶0.5 ml孢子悬液(1.0×107 cfu/ml)，发酵温度30 ℃，培养48 h。
1.2 试剂与溶液1.2.1 β-葡聚糖溶液准确称取0.7 g β-葡聚糖(Amresco)，加入5 ml无水乙醇润湿，再加入80 ml 缓冲液，同时缓慢加热直至β-葡聚糖完全溶解，冷却至室温，用缓冲液定容至100 ml，底物溶液4 ℃保存，2 d内用完。
1.2.2 葡萄糖标准贮备溶液(10 mg/ml)称取烘干至恒重的无水葡萄糖1 g，精确至0.1 mg，用水溶解并定容至100 ml。
1.2.3 葡萄糖标准溶液分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.00、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 ml 于10 ml容量瓶中，用水定容至10 ml，盖塞，摇匀备用。
1.2.4 DNS试剂称取3，5-二硝基水杨酸10 g，置于约600 ml水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50 ℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸钾钠200 g、苯酚(重蒸)2 g 和无水亚硫酸钠5 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1 000 ml，过滤。
贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d后使用。
1.2.5 粗酶液的制备取5 g固体发酵曲于250 ml三角瓶中，加入缓冲液50 ml，振荡抽提1 h，过滤离心去除孢子后，4 ℃保存备用。
1.2.6 缓冲液乙酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲配制液见叶宝兴主编《生物科学基础实验》（2005）。
1.3 标准曲线的制作方法按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准溶液、缓冲溶液和DNS试剂于各管中（每管做3个平行样），混匀。
将标准管同时置于沸水浴中，反应10 min。
取出，迅速冷却至室温，用水定容至25 ml，盖塞，混匀。
在波长550 nm处测量吸光度。
以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
1.4 酶活力测定方法取2支25 ml刻度具塞试管，分别加入1.5 ml 0.7% β-葡聚糖底物溶液（由pH值5.6乙酸-乙酸钠缓冲液配制），置55 ℃水浴中保温5 min。
在其中一支试管中加入0.5 ml稀释酶样，混匀，置于55 ℃水浴中准确反应30 min，加入3 ml DNS试剂至两支试管中，混匀。
在另一支试管(空白管)中加入0.5 ml稀释酶样，同时将两支试管放入100 ℃水浴中反应10 min，取出置于冷水中冷却至室温，加水定容至25 ml，盖塞混匀，在550 nm处测量酶样对空白的吸光度，计算酶活力。
1.5 酶活力计算标准曲线：Y=AX+B。
式中：Y——吸光度；X——葡萄糖量(mg)；A——斜率；B——截距。
式中：1 000——mg与μg之间的换算系数；D——酶液稀释倍数；180——葡萄糖分子量；0.5——测定所取酶液量(ml)；t——反应时间（min）。
β-葡聚糖酶活力单位定义：在测定条件下，每分钟水解β-葡聚糖产生1 μmol还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量，定义为一个酶活力单位（IU）。
2 结果与讨论2.1 最佳吸收波长的确定按照上述标准曲线的制作方法，分别测定在不同波长处的吸光度，制作标准曲线，见表2、图1。
在分光比色测定时，波长的选择不仅需要考虑灵敏度，同时还要考虑数据的稳定性和重复性。
试验测定了不同波长处的OD值制作标准曲线。
由表2、图1可以看出，在相同的糖浓度时，随着波长的升高，OD值呈下降趋势。
在波长为520 nm时，测得的OD值最大，灵敏度最高，但数据的稳定性较差;在波长为570 nm时，测得数据的稳定性较好，但是灵敏度偏低；在波长为550 nm时，测得的数据灵敏度较高，而且稳定性也较好。
所以，最佳测定波长确定为550 nm。
线性回归方程为：Y=0.4309X-0.0124，R2=0.998 3。
2.2 葡萄糖沸水浴显色反应时间的确定分别以3种不同浓度的葡萄糖标准溶液与3 ml DNS试剂经沸水浴显色反应发现，沸水浴时间不同对显色反应结果影响较大，如图2所示，3种糖浓度反应结果相似，均为在1～4 min之间，反应速度较快，OD值增加幅度较大；5～10 min 之间，反应趋于平缓，OD值增加缓慢；10 min以后，所测得的OD值基本保持不变，说明显色反应已经完全，因此，沸水浴显色时间确定为10 min。
2.3 酶活力测定底物浓度的确定底物浓度是决定酶解反应速度的重要因素。
测定β-葡聚糖酶活力时底物浓度一般配制在0.5%~0.8%之间，这个浓度范围达到了酶活力测定时底物过量的要求，既可保证酶和底物的充分反应，又可降低底物中小分子低聚糖对测定结果的影响，试验选用底物浓度为0.7%。
2.4 酶活力测定反应时间的确定（见图3）不同种类的酶其线性反应时间的范围也不同，在酶的线性反应时间内测定的酶活力较为准确。
在相同反应体系下，试验测定了酶解反应从5～120 min时产生的还原糖的量。
由图3可以看出，酶解产生的还原糖在前30 min内线性关系较好，产物生成量与反应时间成正比，在40～80 min之间产物生成速率逐渐减慢，90 min以后产物生成量几乎不再增加。
因此在5～30 min时处于一级反应阶段，产物生成速度一致，是酶活力测定的最佳时间，但反应时间短产物含量低时测定酶活力，会受到粗酶液中其它水解酶作用或底物纯度等因素对酶活力测定带来的干扰，选择产物生成量在2 mg以上的时间比较好，因此应选择30 min作为酶活力测定的反应时间。
2.5 酶活力测定缓冲液种类的确定（见图4）缓冲液的种类和pH值对酶的活性影响较大，同一种酶在不同缓冲液和不同pH值时测定的活性不同。
只有在某种缓冲液和某种pH值范围内才表现出最大活性。
一般认为酶分子处在最适pH值时，其活性基团的解离状态最易与底物结合，而处在其它pH值时，改变了活性基团的解离状态，酶和底物结合减弱，活性就降低。
由图4可知，试验测定了3种不同缓冲液体系条件下的酶活，随着pH值的增大，3种缓冲液体系测得的酶反应活性均呈现出先增加后下降的趋势，但乙酸-乙酸钠缓冲液体系测得的酶活力明显高于其它两种缓冲液体系。
因此，在β-葡聚糖酶活力测定时应选用乙酸-乙酸钠缓冲液体系。
2.6 酶活力测定最佳pH值的确定选择乙酸-乙酸钠缓冲液体系，其它反应条件不变，改变缓冲液体系pH值进行酶活力测定，如图5所示，当pH值为5.6时，测得的OD值最大，酶活力最高。
因此，酶活力测定应在pH值5.6时进行。
2.7 酶活力测定反应温度的确定（见图6）酶解反应时的温度对酶反应速度影响较大，当其它条件不变时，温度每改变1 ℃，反应速度可相差10%以上。
本文在乙酸-乙酸钠缓冲液pH值5.6时，测定了不同温度条件下酶解反应30 min时的产物生成量，如图6所示，随着温度的升高，测得的OD值呈现先升高后下降的趋势，在温度为55 ℃时，测得的OD 值最大，产物生成量最多，酶活力最高。
因此，β-葡聚糖酶活力测定应在55 ℃下进行。
3 结论通过以上对还原糖法β-葡聚糖酶活力测定条件的研究，可以看出在进行酶活力测定时，测定波长、沸水浴显色时间、底物浓度、酶解反应时间、反应缓冲液种类以及反应pH值均对酶活力测定有较大影响。
经试验确定β-葡聚糖酶活力的最佳测定条件为：β-葡聚糖底物浓度0.7%，pH值5.6乙酸-乙酸钠缓冲体系，酶解反应温度55 ℃，酶解反应时间30 min，沸水浴显色10 min，测定波长550 nm。
