NK细胞杀伤活性检测(教学课件)

照组
对照组
靶细胞 效应细胞 1640培养基
100ul 100ul
——
100ul
——
100ul
——
100ul 100ul
—— ——
200ul
NK细胞活性（%）=
实验组OD值 - 效应细胞对照组OD值
（1-
靶细胞对照组OD值
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）×100%
NK细胞活性（%）=
实验组OD值 - 效应细胞对照组OD值 （1-
3、细胞毒试验 按表7-3加样，
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4、孵育 二氧化碳培养箱孵育2小时； 加MTT，继续孵育2小时。
5、测OD值 轻轻吸弃上清，加二甲亚砜150ul ，
振荡5min，静置5min，测OD值。 6、结果分析
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表7-3 MTT法测NK细胞活性试验各组成分(3复孔/组)
实验组 靶细胞对 效应细胞 空白对照
实验四
MTT比色法检测小鼠脾脏NK细胞活性
由NordriDesign™提供
（MTT比色法检测小鼠脾脏NK细胞活性）
原理： 1、制备小鼠脾细胞（含NK细胞） 2、NK细胞与肿瘤细胞（ YAC-1 ）共孵育，NK活
性越强，肿瘤细胞被杀死越多。 3、MTT底物可被活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶还
靶细胞对照组OD值
）×100%
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附：P53细胞计数公式：
细胞浓度（细胞数/ml原液）=
4大格内的细胞总数 4
×10000×稀释倍数
Page 10
A
C
B
D
Page 11
（8）用1ml 1640培养液溶解脾细胞沉淀，混匀， 配成脾细胞悬液（原液），计数（吸取20ul加入 780ul白细胞稀释液中，稀释40倍，用血球计数 板在显微镜下计数，根据P53页公式计算脾细胞 悬液原液中脾细胞浓度）；

精品课件
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细胞因子诱导记忆性NK细胞
• 在免疫应答中, NK的活化依赖于CK信号而非特异 性抗原受体。APC分泌的多种CK, 如IL-1、IL-12、 IL-15 和IL-18 都会对NK 有活化作用。
• 更新研究显示, CK可以诱导NK产生记忆样NK, 当受到再次刺激时, 可以产生更多的IFN-γ 并在 体内发生增殖。
• Cooper 等 建立的体内过继转输模型,证实了NK 具有免疫记忆的特性。
• 由IL-12 及IL-18 活化的NK 细胞过继转输到未
受刺激的小鼠体内。与对照组比较,实验组受到
CK再次刺激时, 活化的NK可以产生更强的免疫应
答, 即可以分泌更多的精I品F课N件-γ。
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• 总之, 研究表明NK 细胞具备适应性免 疫细胞独有的记忆性，还具有扩增性。
并表现为活化表型, CD69 及NKG2D 的表达均升
高并产生IFN-γ, 之后逐渐凋亡至初始的细胞数量,
即形成记忆性NK 细胞 。
精品课件
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• 与未受感染的初始NK 细胞相比, 记忆NK 细胞有 能力产生更多的IFN-γ, 并能更迅速地脱颗粒发挥 杀伤功能。
• 实验也显示，过继转输同等数量的初始NK 细胞 或记忆性NK 细胞至新生鼠体内, 当新生鼠感染巨 细胞病毒后, 转输记忆性NK的新生鼠生存率更高, 而当阻断Ly49H 这一受体时, 生存率即下降。由 此可见, 记忆性NK 细胞对感染的病毒具有记忆性。
• NK1.1和Ly49为小鼠特异性标志分子。
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4
表面受体
杀伤细胞活化受体和杀伤细胞抑制受体。
按照其识别的配体不同分为以下两大类：
1 识别 HLA-I类分子的受体 2 识别非HLA-I类分子的受体

ppt课件.
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（一）NK自然杀伤细胞（NK cells） PBMNC （50ml 外周血）
培养12-14天
NK细胞培养
NK细胞数量可达 0.5~3×109
ppt课件.
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用正常健康人由来的PBMC的实验例
36 yr／male
22.77%= 5.08%+17.69%
94.81%= 3.81%+91%
ppt课件.
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国内权威报道
中央新闻联播对生物细胞免 疫疗法最权威报道：肿瘤生物治 疗获得重大突破，早期癌症三分 之一可治愈。
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NK免疫细胞疗法
NK细胞免疫疗法也称为生物免疫疗法中的细胞治疗方 法，具体方法是：通过提取患者体内不成熟的免疫细胞 （采血），在实验室中进行活化培养使其具有高效识别和 杀灭肿瘤细胞的能力后，再回输患者体内。患者只需配合 做采血与回输血两个步骤，无需住院。
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4
癌症的三大常规治疗
２．化疗--Biblioteka 轰炸机肿瘤内科治疗的基石对肿瘤细胞的杀伤缺乏选 择性
损伤正常组织
Goldie-Coldman假说及“一 级动力学”理论：化疗对 数杀灭细胞，不可能彻底 清除肿瘤细胞
ppt课件.
5
癌症的三大常规治疗
1898 年发现镭 镭用于治疗肿瘤
放疗有效破坏或消灭 癌细胞，甚至可以治 愈部分肿瘤
禁忌症：①、怀孕或正在哺乳期妇女； ②、脏器移植者； ③、严重自身免疫性疾病患者； ④、不可控制的感染性疾病患者； ⑤、对生物制剂过敏者； ⑥、T细胞淋巴瘤患者；
⑦、正在进行全身放疗、化疗的患者； ⑧、晚pp期t课件肿. 瘤造成的恶病质、外周血象过低患者。1。8

1只/组
2. YAC-1 1*105 * 2ml 3. 培养液（1640) 无FCS
5ml/ 组
3. 培养液(1640) 3%FCS
10ml/组
3. LDH底物
3ml/组
4. 柠檬酸（终止液）1ml/组
·3·
原理
免疫学实验
➢ NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞， 为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细 胞并列的第三类群淋巴细胞。 ➢ NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性 既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无 MHC限制。 ➢YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV) 感染的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测 NK细胞的杀伤活性。
·8·
乳酸脱氢酶释放法-原理
免疫学实验
乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，
不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内 释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮 酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶 (NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还 原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形 成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利 用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
Or Protein
cpm
SI
试验孔cpm均值－自然释放孔 cpm均值 最大释放孔 cpm均值－自然释放孔 cpm均值
·7·
同位素释放法
免疫学实验
❖应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶 细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡 靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数 （cpm)， 即可计算出NK细胞活性。