植物叶色黄化突变分子机理的研究进展-南方农业学报

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２４ꎬ４０(１):１６５￣１７３ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ张朝阳ꎬ程㊀瑞ꎬ徐兵划ꎬ等.ＢＳＡ联合转录组分析发掘西瓜叶片黄化候选基因[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２４ꎬ４０(１):１６５￣１７３.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２４.０１.０１８ＢＳＡ联合转录组分析发掘西瓜叶片黄化候选基因张朝阳ꎬ㊀程㊀瑞ꎬ㊀徐兵划ꎬ㊀顾㊀妍ꎬ㊀黄大跃ꎬ㊀孙玉东(江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所/淮安市设施蔬菜重点实验室ꎬ江苏淮安２２３００１)收稿日期:２０２２￣１１￣２８基金项目:淮安市农业科学研究院发展基金项目(ＨＡＮ２０１７１４)ꎻ淮安市自然科学研究技术专项(ＨＡＢ２０２０７９)ꎻ国家西甜瓜产业技术体系淮安综合试验站项目(ＣＡＲＳ￣２５)作者简介:张朝阳(１９８２－)ꎬ男ꎬ江苏连云港人ꎬ硕士ꎬ副研究员ꎬ从事西甜瓜遗传育种研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)２８７３６２７０３＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ程瑞为共同第一作者ꎮ通讯作者:孙玉东ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｓｕｎｙｕｄｏｎｇ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀叶片是植物重要的功能器官之一ꎬ不仅是植株进行光合作用的主要场所ꎬ也可作为重要的形态标记ꎬ应用于育种中ꎮ叶片颜色作为形态标记ꎬ不仅可用于苗期杂种的清除ꎬ亦可用于种子纯度的测定ꎮ以西瓜全生育期叶片黄化突变体纯合自交系ｌｙ１０４为母本(Ｐ１)㊁绿叶自交系ｗ３为父本(Ｐ２)ꎬ通过杂交创制Ｆ１代㊁Ｆ２代㊁ＢＣ１代群体ꎮ遗传分析结果表明ꎬ该突变体的叶片黄化由单隐性基因控制ꎮ采用混合分组分析(ＢＳＡ)进行初定位ꎬ通过简化基因组测序(ＲＡＤ)开发全基因组单核苷酸多态性(ＳＮＰ)标记构建西瓜高密度遗传图谱ꎬ将西瓜叶片黄化基因定位于２号染色体１３９５０３０６~１５５１７５９１ｂｐ(大小约为１ ５７Ｍｂ)ꎮ以西瓜９７１０３ｖ２为参考基因组ꎬ该区间包含２４个注释基因ꎮ对Ｐ１(Ｐ１Ｙ)㊁Ｐ２(Ｐ２Ｇ)和Ｆ２代群体中黄叶(Ｆ２Ｙ)㊁绿叶(Ｆ２Ｇ)株系进行转录组水平分析ꎬ结果表明ꎬ目标区间内基因Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９５０㊁Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０１０㊁Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０２０㊁Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０在黄化叶片与正常绿叶材料中的表达量差异显著ꎬ可能是西瓜叶片的黄化候选基因ꎮ研究结果可为进一步解析西瓜叶片黄化基因功能和生物学特性奠定重要基础ꎮ关键词:㊀西瓜ꎻ黄化ꎻＢＳＡꎻ遗传图谱ꎻ基因定位中图分类号:㊀Ｓ６５１.０１㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２４)０１￣０１６５￣０９ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｓｆｏｒｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｌｅａｆｙｅｌｌｏｗｉｎｇｂａｓｅｄｏｎＢＳＡａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓＺＨＡＮＧＣｈａｏ￣ｙａｎｇꎬ㊀ＣＨＥＮＧＲｕｉꎬ㊀ＸＵＢｉｎｇ￣ｈｕａꎬ㊀ＧＵＹａｎꎬ㊀ＨＵＡＮＧＤａ￣ｙｕｅꎬ㊀ＳＵＮＹｕ￣ｄｏｎｇ(ＨｕａｉｙｉｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＸｕｈｕａｉＤｉｓｔｒｉｃｔｏｆＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ/ＨｕａｉａｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＦａｃｉｌｉｔｙＶｅｇｅｔａｂｌｅｓꎬＨｕａｉａｎ２２３００１ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｔｈｅｌｅａｆｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｏｒｇａｎｓｏｆｐｌａｎｔｓ.Ｉｔｉｓｎｏｔｏｎｌｙｔｈｅｍａｉｎｐｌａｃｅｆｏｒｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｌａｎｔｓꎬｂｕｔａｌｓｏｃａｎｂｅｕｓｅｄａｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｍａｒｋｅｒｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇ.Ａｓａｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｍａｒｋｅｒꎬｌｅａｆｃｏｌｏｒｃａｎｂｅｕｓｅｄｎｏｔｏｎｌｙｆｏｒｒｅｍｏｖｉｎｇｈｙｂｒｉｄｓａｔｔｈｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｔａｇｅꎬｂｕｔａｌｓｏｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｓｅｅｄｐｕｒｉｔｙ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬＦ１ꎬＦ２ꎬａｎｄＢＣ１ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｃｒｅａｔｅｄｂｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎꎬａｎｄｔｈｅｍｕｔａｎｔｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｌｙ１０４ｉｎｔｈｅｗｈｏｌｅｇｒｏｗｔｈｐｅｒｉｏｄｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｆｅｍａｌｅｐａｒｅｎｔ(Ｐ１)ꎬａｎｄｔｈｅｇｒｅｅｎｌｅａｆｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｗ３ｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｍａｌｅｐａｒｅｎｔ(Ｐ２).Ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｌｅａｆｙｅｌｌｏｗｉｎｇｗａｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｂｙａｓｉｎｇｌｅｒｅｃｅｓｓｉｖｅｇｅｎｅ.Ｔｈｅｂｕｌｋｅｄｓｅｇｒｅｇａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ(ＢＳＡ)ｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｐｒｉｍａｒｙｍａｐｐｉｎｇꎬａｎｄｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ(ＳＮＰ)ｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ￣ｓｉｔｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄＤＮＡ￣ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ(ＲＡＤ)ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｈｉｇｈ￣ｄｅｎｓｉｔｙｇｅｎｅｔｉｃｍａｐｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ.Ｔｈｅｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｌｅａｆｙｅｌｌｏｗｉｎｇｇｅｎｅｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ２ａｔ１３９５０３０６￣１５５１７５９１ｂｐ(ａｂｏｕｔ１.５７Ｍｂ).Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ９７１０３ｖ２ｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｏｍｅａｎｄｔｈｅｉｎ￣ｔｅｒｖａｌｃｏｎｔａｉｎｅｄ２４ａｎｎｏｔａｔｅｄｇｅｎｅｓ.ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｌｅｖｅｌｓｏｆＰ１(Ｐ１Ｙ)ꎬＰ２(Ｐ２Ｇ)ａｎｄｙｅｌｌｏｗｌｅａｆ(Ｆ２Ｙ)ａｎｄｇｒｅｅｎｌｅａｆ(Ｆ２Ｇ)ｌｉｎｅｓｉｎＦ２ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９５０ꎬＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０１０ꎬＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０２０ａｎｄＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０ｉｎｔｈｅｔａｒｇｅｔｉｎｔｅｒｖａｌｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｅｔｗｅｅｎｅｔｉｏ￣ｌａｔｅｄｌｅａｖｅｓａｎｄｎｏｒｍａｌｇｒｅｅｎｌｅａｖｅｓ.Ｔｈｅｓｅｇｅｎｅｓｍｉｇｈｔｂｅｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｓｆｏｒｅｔｉｏｌａｔｉｏｎｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｌｅａｖｅｓ.Ｔｈｅｒｅ￣５６１ｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃａｎｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｌｅａｆｙｅｌｌｏｗｉｎｇｇｅｎｅｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎꎻｅｔｉｏｌａｔｉｏｎꎻＢＳＡꎻｇｅｎｅｔｉｃｍａｐꎻｇｅｎｅｌｏｃａｔｉｏｎ㊀㊀叶片是植物进行光合作用最主要的器官ꎬ对植物的生存具有重要意义ꎬ叶片颜色在很大程度上决定了植物的光合效率[１]ꎮ植物叶色突变不仅是研究叶绿素相关基因功能及植物发育的重要材料[２]ꎬ也是优良的形态标记性状ꎬ在实际生产中常被用来进行品种纯度鉴定[３]ꎮ关于水稻㊁大麦㊁小麦㊁玉米㊁棉花㊁大豆㊁蚕豆㊁番茄㊁拟南芥等多种植物叶色突变的研究已有报道[４]ꎬ叶色突变类型丰富多样ꎬ包括白化㊁黄化㊁黄绿化等[５￣６]ꎮ植株叶色的形成不仅受到叶绿体生物合成途径㊁叶绿素降解途径㊁血红素代谢途径㊁类胡萝卜素代谢途径等与光合色素代谢途径相关基因的影响ꎬ受到与叶绿体发育相关基因的调控ꎬ还与光㊁温度㊁植物激素㊁矿物元素和金属离子等外界环境因素息息相关[６￣９]ꎮ目前ꎬ关于水稻㊁玉米㊁拟南芥等模式植物中叶色的研究较为深入ꎬ水稻㊁玉米中已报道的叶色突变体均超２００个[１０￣１３]ꎬ对拟南芥的研究发现ꎬ叶色突变以隐性遗传为主ꎬ目前已经发现２７个编码１５种叶绿素生物合成酶的核基因ꎬ它们的任何异常突变都会导致叶绿素缺乏ꎬ从而产生黄色突变[１４]ꎮ近年来ꎬ随着高通量测序技术的应用ꎬ关于辣椒㊁甜瓜和黄瓜等一些重要经济作物的叶色突变研究也逐渐展开[１５￣１９]ꎮ西瓜是全球十大水果之一ꎬ中国西瓜栽培面积和消费量均居世界首位ꎮ随着杂交育种的发展ꎬ西瓜育种已基本实现杂种一代化ꎬ对制种纯度提出了更大挑战ꎬ叶形㊁叶色虽是重要的形态标记性状ꎬ但尚未应用于育种中ꎮ西瓜的遗传基础狭窄ꎬ自然突变率低ꎬ目前有关西瓜叶色突变的报道有斑驳突变类型[２０]㊁白化突变类型[２１￣２２]㊁不完全显性黄叶突变类型[２２]㊁后绿突变类型[２３]㊁黄化突变类型[２４￣２５]等ꎬ但研究主要集中于遗传规律㊁生理特性[２１￣２５]ꎮ西瓜基因组的公布和测序技术的快速发展为西瓜重要性状定位㊁关键基因功能研究奠定了重要生物学基础[２６￣２９]ꎮＫｉｄａｎｅｍａｒｉａｍ[３０]发现ꎬ西瓜后绿突变体Ｈｏｕｌｖ中的ＣｌＣＧ０３Ｇ０１００３０基因存在１个单核苷酸多态性(ＳＮＰ)变异ꎬ导致该基因编码的ＦｔｓＨ胞外蛋白酶序列中精氨酸突变为赖氨酸ꎬＦｔｓＨ蛋白主要参与叶绿体早期发育ꎬ进而影响西瓜叶片颜色ꎮＺｈｕ等[２５]对叶片黄化突变西瓜材料ｗ￣ｙｌ进行精细定位ꎬ认为基因Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０４０㊁Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０５０和Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０可能是导致西瓜叶片黄化的主要基因ꎮ探索叶片颜色变异机制可为遗传改良提供理论依据ꎬ满足人们在生产㊁选种和育种等方面的需求ꎻ开发叶色形态标记ꎬ能够有效缩短育种周期ꎬ提高育种效率与制种纯度ꎮ本研究拟以全生育期叶片黄化西瓜材料ｌｙ１０４和绿叶西瓜材料ｗ３为试验材料ꎬ通过混合分组分析(ＢＳＡ)测序初步定位叶片黄化基因在染色体中的位置ꎬ进一步利用简化基因组(ＲＡＤ)测序开发全基因组ＳＮＰ分子标记ꎬ利用Ｆ２代群体构建高密度遗传图谱进行西瓜叶片黄化基因定位ꎬ结合转录组测序及基因功能注释锁定关键候选基因ꎮ本研究结果可为进一步全面解析西瓜叶片黄化基因及其生物学功能奠定重要基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料２０１４年ꎬ利用甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)诱变获得的稳定遗传的叶片黄化西瓜材料ꎬ经５代连续自交获得相对纯合的叶片黄化突变材料ｌｙ１０４ꎮ本研究以ｌｙ１０４为母本(Ｐ１)ꎬ以正常绿叶西瓜材料ｗ３为父本(Ｐ２)构建Ｆ１代㊁Ｆ２代㊁ＢＣ１代群体ꎬ群体的构建与表型调查试验均于淮安市农业科学研究院科研创新基地进行ꎬ群体配制过程严格自交㊁杂交ꎬ整个生育期采取商品化管理ꎮ１.２㊀形态观察与遗传规律分析以第１张完全展开的真叶进行表型统计与分析ꎬ采用人工观察和便携式色差仪ＲＭ２００ＱＣ(爱色丽Ｘ￣Ｒｉｔｅꎬ美国)对叶片颜色指数进行测定ꎬ测定指标为亮度值(Ｌ∗)㊁红绿值(ａ∗)和黄蓝值(ｂ∗)３个颜色参数ꎮ对Ｆ１代㊁Ｆ２代㊁ＢＣ１代群体分离表型进行统计ꎬ分析西瓜叶片黄化遗传规律ꎬ并进行卡方检验ꎮ１.３㊀通过ＢＳＡ测序进行叶片黄化初定位ＢＳＡ测序即混合分组分析法ꎬ是一种简单快速的目标性状定位方法ꎬ已被广泛应用于多种园艺作物重要性状的基因定位[３１]ꎮ本研究从Ｆ２代西瓜群体中选取黄叶㊁绿叶极端表型植株各２０株ꎬ采用十六烷基三甲基溴化铵(ＣＴＡＢ)法[３２]提取植株幼叶基６６１江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期因组ＤＮＡ并检测其浓度ꎬ通过等量混匀构建２个极端混池ꎬ利用亲本ＤＮＡ构建亲本池进行测序分析ꎬ送至上海凌恩生物科技有限公司ꎬ利用ＩｌｌｕｎｉｍａＨｉＳｅｑ４０００进行测序ꎬ亲本测序深度为１０ˑꎬ混池测序深度为２０ˑꎬ测序读长为１５０ｂｐꎮ对原始序列(Ｒｅａｄ)进行过滤ꎬ去除接头ꎬ过滤掉包含未确定碱基(Ｎ)>１５％和低质量的ｒｅａｄ(质量值ɤ２０的碱基数占整个Ｒｅａｄ的１０％以上)ꎬ将获得的干净序列(Ｃｌｅａｎｒｅａｄ)用于后续分析ꎮ使用ＢＷＡ软件[３３]将高质量的Ｃｌｅａｎｒｅａｄ映射到西瓜基因组９７１０３ｖ２(ｈｔ￣ｔｐ://ｃｕｃｕｒｂｉｔｇｅｎｏｍｉｃｓ.ｏｒｇ/ｏｒｇａｎｉｓｍ/２１)上ꎮ然后用ＧＡＴＫ[３４]㊁ＳｎｐＥｆｆ[３５]软件对突变位点进行检测和注释ꎬ用ＳＮＰ￣ｉｎｄｅｘ算法进行关联分析ꎬ阈值为０ ５ꎮ１.４㊀西瓜高密度遗传图谱的构建为了更精确地定位获得西瓜叶片黄化突变位点ꎬ本研究根据Ｆ２代群体中黄叶㊁绿叶分离比选取共１００份单株ꎬ分别提取基因组ＤＮＡꎬ采用ＲＡＤ建库方式构建长度范围在３００~５００ｂｐ的双端文库ꎮ将产物送至上海凌恩生物科技有限公司ꎬ利用ＩｌｌｕｎｉｍａＨｉＳｅｑ进行测序ꎬ测序读长为１５０ｂｐꎮ对原始Ｒｅａｄ采用以下标准进行质控:(１)去除Ｒｅａｄ中的接头序列ꎻ(２)修剪测序质量较低的Ｒｅａｄ末端(测序质量值小于Ｑ２０)ꎻ(３)去除含Ｎ比例达到１０％的Ｒｅａｄꎻ(４)舍弃接头及质量修剪后长度小于１００ｂｐ的小片段ꎮ用ＢＷＡ软件将Ｃｌｅａｎｒｅａｄ比对至参考基因组９７１０３ｖ２ꎬ并对映射结果进行统计分析ꎮ用ＧＡＴＫ软件进行变异位点检测获得ＳＮＰꎮ对获得的ＳＮＰ按以下标准进行过滤:(１)去除比对Ｒｅａｄ质量值小于２０的位点ꎬ同时过滤掉缺失率大于５０％的ＳＮＰꎻ(２)删除无义ＳＮＰ位点ꎻ(３)用ｊｏｉｎｍａｐ４.０软件[３６]对过滤后的ＳＮＰ进行卡方测验ꎬ先后过滤掉Ｐ<０ ０１和缺失率３０％以上的标记ꎬ对于最终获得的ＳＮＰꎬ采用ｊｏｉｎｍａｐ４.０软件进行西瓜遗传图谱构建ꎬ选用Ｋｏｓａｍｂ ｓ参数ꎮ１.５㊀转录组分析从亲本及其Ｆ２代群体中取ｌｙ０４和ｗ３单株各３份ꎬ当第１张真叶完全展开后取样进行转录组分析ꎮ用ＰｌａｎｔＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ试剂盒(购自上海凌恩生物科技有限公司)提取植物总ＲＮＡꎬ并构建转录组测序文库ꎮ送至上海凌恩生物科技有限公司采用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ进行测序ꎬＲｅａｄ长度为１５０ｂｐꎮ测序数据经质控过滤获得Ｃｌｅａｎｒｅａｄꎬ用Ｈｉｓａｔ２软件[３７]将其映射到西瓜基因组９７１０３ｖ２上ꎮ用每个基因在一个样本中所对应的基因转录本数(ＦＰＫＭ)计算基因表达水平ꎮ基于ＫＥＧＧ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅ￣ｎｏｍｅ.ｊｐ/ｋｅｇｇ/)和ＧＯ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ.ｏｒｇ/)数据库进行基因注释和功能分析ꎮ差异表达基因以差异倍数(Ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ)ȡ１ ５㊁Ｐɤ０ ００５为标准ꎮ１.６㊀候选区域功能注释与候选基因筛选结合遗传规律分析及ＢＳＡꎬ利用ＲＡＤ测序开发全基因组ＳＮＰ标记ꎬ加入叶色表型标记进行西瓜２号染色体图谱的构建ꎬ对西瓜叶片黄化基因进行定位ꎮ以９７１０３ｖ２为参考基因组对定位区间基因进行注释ꎬ通过基因序列分析及转录组测序差异表达情况分析进一步筛选并确定候选基因ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀西瓜叶片黄化特性及遗传规律分析经ＥＭＳ诱变获得叶片黄化的西瓜材料ꎬ经５代连续自交后ꎬ获得遗传稳定的叶片黄化材料ｌｙ１０４ꎬ该材料从子叶期至果实收获时的叶片均保持黄化状态(图１Ａ)ꎮ通过对ｌｙ１０４㊁ｗ３的叶片颜色指标进行测定ꎬ发现叶片黄化西瓜材料与绿叶西瓜材料在叶片颜色指标上存在极显著差异(图１Ｂ)ꎮ㊀㊀分析结果显示ꎬｌｙ１０４和ｗ３的杂交Ｆ１代所有植株叶片均呈绿色ꎬ表明控制黄色和绿色的基因是等位基因ꎬ黄色的突变基因为隐性遗传ꎮＦ２代群体中有１７４个单株为绿叶ꎬ６３个单株为黄叶(表１)ꎮ在Ｆ１代与叶片黄化亲本(Ｐ１)回交群体后代中ꎬ有７３个单株为绿叶ꎬ６３个单株为黄叶ꎮ卡方检验发现ꎬＦ２代群体的分离比符合３ʒ１的孟德尔分离比[χ２(１ꎬｎ＝２３７)＝０.３１６４６ꎬＰ＝０.５７３７>０ ０５００ꎬｎ为群体样本数量]ꎬＢＣ１群体的分离模式符合１ʒ１的孟德尔分离比[χ２(１ꎬｎ＝１３６)＝０.７３５２９ꎬＰ＝０.３９１２>０ ０５００](表１)ꎬ说明西瓜叶片的黄色突变符合单基因控制的隐性遗传规律ꎬ叶片绿叶对黄色表现为显性遗传ꎮ表１㊀Ｆ２代和ＢＣ群体中叶片黄化突变型与野生型的分离比Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｙｅｌｌｏｗ￣ｌｅａｆｍｕｔａｎｔａｎｄｗｉｌｄｔｙｐｅｉｎＦ２ａｎｄＢＣｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ群体类型群体数量绿叶植株数量黄叶植株数量期望分离比卡方检验值(χ２)ＢＣ１１３６７３６３１ʒ１０.７４Ｆ２２３７１７４６３３ʒ１０.３２χ２检验采用０.０５水平ꎮ７６１张朝阳等:ＢＳＡ联合转录组分析发掘西瓜叶片黄化候选基因Ａ:表型ꎻＢ:颜色指数ꎮＬ∗:亮度(阈值０~１００)ꎻａ∗:红绿色范围(阈值－１２８~＋１２７)ꎻｂ∗:黄蓝色范围(阈值－１２８~＋１２７)ꎻＭＴ:突变体叶片黄化材料ꎻＷＴ:野生型材料ꎮ∗∗表示不同材料间差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图１㊀西瓜绿叶和黄叶突变体的表型及颜色指数Ｆｉｇ.１㊀Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎｄｃｏｌｏｒｉｎｄｅｘｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｇｒｅｅｎ￣ｌｅａｆｍｕｔａｎｔａｎｄｙｅｌｌｏｗ￣ｌｅａｆｍｕｔａｎｔ２.２㊀西瓜叶片黄化基因的ＢＳＡ初定位原始Ｒｅａｄ经质控过滤ꎬ２个混池共获得１２.４Ｇｂ高质量ＣｌｅａｎｒｅａｄꎬＱ３０在９３ ０％以上ꎬ与参考基因组９７１０３ｖ２的平均比对率在９８ ０％以上ꎮ使用ＧＡＴＫ软件进行变异检测ꎬ共获得５２３３０３个ＳＮＰꎬ经过滤后用ＳＮＰ￣Ｉｎｄｅｘ算法对性状相关侯选区域进行选择ꎬ作图窗口大小为１Ｍｂꎬ作图步移为１０ｋｂꎬ阈值为０ ５ꎬ结果表明ꎬ西瓜叶色黄化基因定位于２号染色体８４９０００１~２６４１００００ｂｐ(大小约为１７ ９２Ｍｂ)(图２Ａ)ꎮ２.３㊀高密度西瓜遗传图谱的构建与叶片黄化基因的定位㊀㊀根据分离比ꎬ从Ｆ２代群体中选取７６株绿叶㊁２４株黄叶西瓜单株进行ＲＡＤ测序ꎬ共获得６９ １７Ｇｂ高质量ＣｌｅａｎｒｅａｄꎬＱ３０在９１ ３％以上ꎬ与参考基因组的平均比对率在９７ ６％以上ꎮ使用ＧＡＴＫ软件进行变异检测ꎬ共获得２２９７０４个ＳＮＰꎬ经过滤筛选ꎬ最终确定４２７３个ＳＮＰ用于西瓜高密度遗传图谱的构建ꎮ西瓜遗传图谱总长度为１６０２.４４ｃＭꎬ平均遗传距离为０ ３９ｃＭꎬ最大间隔为７ ３８ｃＭ(表２)ꎮ㊀㊀为了进一步精确定位西瓜叶片黄化基因ꎬ用ＲＡＤ测序结果对西瓜２号染色体上的ＳＮＰ标记进行过滤筛选ꎬ剔除检测率低于４０％的样品单株和标记ꎬ最终用９１份单株(６８份绿叶ꎬ２３份黄叶)㊁２８６个ＳＮＰ标记进行叶片黄化基因定位ꎬ叶片颜色标记(Ｌｅａｆｃｏｌｏｒ)用绿叶(Ｄ)㊁黄叶(Ｂ)表示ꎬ用ｊｏｉｎｍａｐ４进行西瓜叶片黄化基因的定位ꎮ结果显示ꎬＬｅａｆｃｏｌ￣ｏｒ定位于Ｃｌａｓ９７Ｃｈｒ０２￣１３９５０３０６与Ｃｌａｓ９７Ｃｈｒ０２￣１５５１７５９１标记之间(大小约为１ ５６７Ｍｂ)(图２Ｂ)ꎬ以西瓜９７１０３ｖ２为参考基因组ꎬ该区间包含２４个注释基因(图２Ｃ㊁表３)ꎮ表２㊀西瓜高密度遗传图谱构建结果Ｔａｂｌｅ２㊀Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｇｅｎｅｔｉｃｍａｐｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ基因组位置标记数量遗传长度(ｃＭ)平均遗传距离(ｃＭ)标记最大间隔(ｃＭ)Ｌｇ０１４３７１６１.１５０.３７２.６２Ｌｇ０２５０４１８５.４９０.３７２.３２Ｌｇ０３１０９６０.１３０.５５３.１６Ｌｇ０４６２８２７８.３２０.４４３.８７Ｌｇ０５３１４１１４.８１０.３７２.８７Ｌｇ０６３８０９５.０８０.２５２.７５Ｌｇ０７４８１１８６.９００.３９２.８２Ｌｇ０８２０５７２.０３０.３５２.１７Ｌｇ０９４３７１４７.５２０.３４２.２１Ｌｇ１０４５９１２１.６００.２６２.４０Ｌｇ１１３１９１７９.４１０.５６７.３８合计４２７３１６０２.４４０.３９－８６１江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期２.４㊀西瓜黄化叶片转录组分析及候选基因的筛选ＲＮＡ￣ｓｅｑ共检测１２个样本ꎬ其中Ｐ１㊁Ｐ２分别选取３个样本ꎬＦ２代群体中叶片黄化类型㊁绿叶类型分别选取３个样本ꎬ每个样本平均获得６ ４Ｇｂ高质量Ｃｌｅａｎｒｅａｄ数据ꎬＱ３０在９２ ０％以上ꎬ平均基因组比对率为９１ ４％ꎮ分别以Ｐ２Ｇ(亲本绿叶)与Ｐ１Ｙ(亲本黄叶)和Ｆ２Ｇ(Ｆ２代绿叶)与Ｆ２Ｙ(Ｆ２代黄叶)为对比组进行独立分析ꎬ其中Ｐ２Ｇ与Ｐ１Ｙ对比组中共检测到１３５６个差异表达基因ꎬ其中上调表达的基因５２９个ꎬ下调表达的基因８２７个ꎻＦ２Ｇ与Ｆ２Ｙ对比组中共检测到４１８０个差异表达基因ꎬ其中上调表达的基因１３７８个ꎬ下调表达的基因２８０２个(图３Ａꎬ图３Ｂ)ꎮＰ２Ｇ与Ｐ１Ｙ对比组和Ｆ２Ｇ与Ｆ２Ｙ对比组中均显著下调表达的基因共有３２７个㊁均显著上调表达的基因共有１３２个(图３Ａ)ꎮ以上结果表明ꎬ亲本中黄叶和绿叶差异表达基因数量显著小于Ｆ２代群体ꎬ说明Ｐ１和Ｐ２已相对纯合ꎻＧＯ和ＫＥＧＧ富集分析结果表明ꎬ差异表达基因富集通路多与光合㊁应激反应等有关ꎬ说明黄叶和绿叶西瓜植株在光合作用等方面存在较大差异ꎮ表３㊀候选区间注释基因Ｔａｂｌｅ３㊀Ｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｎｏｔａｔｉｏｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｃａｎｄｉｄａｔｅｉｎｔｅｒｖａｌ基因㊀㊀染色体起始位置(ｂｐ)终止位置(ｂｐ)基因方向基因功能注释㊀㊀㊀㊀㊀Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５８９０染色体２１３９５６４１７１３９５７３２７－ａｃａｎｔｈｏｓｃｕｒｒｉｎ￣１￣ｌｉｋｅＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９００染色体２１４０２９９６８１４０３１１１０－未知的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９１０染色体２１４０３１２０２１４０３２２６５－ａｃａｎｔｈｏｓｃｕｒｒｉｎ￣１￣ｌｉｋｅＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９２０染色体２１４０３３５８０１４０３７３７９－未知的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９３０染色体２１４０５５６７６１４０５７３７８－含ＢＰＴＩ/Ｋｕｎｉｔｚ结构域的蛋白质２亚型Ｘ２Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９４０染色体２１４１５７１２２１４１５８３１０＋未知的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９５０染色体２１４２０１３７３１４２０２３７５－与ＴＭＡ７相关的翻译机制蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９６０染色体２１４２６７３１０１４２７０８０９－Ｂ类锌指蛋白质转录因子ꎬ包含ＤＵＦ１６６４结构域Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９７０染色体２１４２７０９０６１４２７４８４７＋脂质结合血清糖蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９８０染色体２１４２７７６８６１４２７８９０４－蛋白质核融合缺陷６ꎬ叶绿体/线粒体样亚型Ｘ１Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９９０染色体２１４２８３０４７１４２８３３２９＋未知的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０００染色体２１４３７００８６１４３７２００２＋抗坏血酸氧化酶同源物Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０１０染色体２１４３７６４３９１４３７６７８２＋未知的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０２０染色体２１４４６１３７６１４４６４３０７－双组分反应调节蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０３０染色体２１４４９４６０７１４４９７１１４＋双组分反应调节蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０４０染色体２１４５４９７６５１４５５０４２５＋包含ＤＵＦ６７９结构域的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０５０染色体２１４５５０６２６１４５５１９３５－ＤＮＡＪ同源亚家族Ｂ成员１３Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０染色体２１４６７０６９３１４６７１７０７＋蛋白质Ｙｃｆ２Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０７０染色体２１４８３７２１９１４８７５２７７－Ｕ１１/Ｕ１２小核核糖核蛋白(相对分子质量６５０００)蛋白质亚型Ｘ２Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０８０染色体２１４９９０５２０１４９９０７１９－未知的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０９０染色体２１５０５９８９９１５０６３２０９＋环型Ｅ３泛素转移酶Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６１００染色体２１５１５５２０９１５１５７４５６＋含五肽重复的家族蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６１１０染色体２１５１６５１４２１５２２６９８６＋尼曼￣匹克Ｃ１蛋白样亚型Ｘ２Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６１２０染色体２１５２３１４６０１５２３１９７６－锌指家族蛋白质＋ 表示基因注释在染色体正链ꎻ － 表示基因注释在染色体负链ꎮ㊀㊀对西瓜２号染色体１３９５０３０６~１５５１７５９１ｂｐ(大小约为１ ５６Ｍｂ)内的２４个注释基因进行功能分析和转录组表达差异分析ꎬ结果显示ꎬ２４个注释基因中有１７个在植株叶片中表达ꎬ仅有基因Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０㊁９６１张朝阳等:ＢＳＡ联合转录组分析发掘西瓜叶片黄化候选基因Ａ:ＢＳＡ定位结果ꎮＢ:西瓜２号染色体遗传图谱及叶色黄化标记定位ꎮＣ:根据西瓜参考基因组９７１０３ｖ２注释候选区域的基因ꎮＳＮＰｉｎｄｅｘ:单核苷酸多态性指数ꎮ图２㊀西瓜叶片黄化基因精细定位Ｆｉｇ.２㊀ＦｉｎｅｍａｐｐｉｎｇｏｆｌｅａｆｙｅｌｌｏｗｉｎｇｇｅｎｅｓｉｎｗａｔｅｒｍｅｌｏｎＡ:Ｐ２Ｇ与Ｐ１Ｙ对比组及Ｆ２Ｇ与Ｆ２Ｙ对比组上调和下调基因数量Ｖｅｎｎ图ꎻＢ:Ｐ２Ｇ与Ｐ１Ｙ对比组及Ｆ２Ｇ与Ｆ２Ｙ对比组上调和下调基因数量柱形图ꎻＣ:Ｆ２Ｇ与Ｆ２Ｙ对比组差异基因火山图ꎬ标注基因为候选区间基因ꎮＰ１Ｙ:亲本黄叶ꎻＰ２Ｇ:亲本绿叶ꎻＦ２Ｇ:Ｆ２代绿叶ꎻＦ２Ｙ:Ｆ２代黄叶ꎮ图３㊀西瓜黄叶与绿叶转录组差异表达基因分析Ｆｉｇ.３㊀Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｙｅｌｌｏｗｌｅａｆａｎｄｇｒｅｅｎｌｅａｆ０７１江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９５０㊁Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０１０㊁Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０２０在叶片黄化植株与绿叶植株中的表达存在显著差异ꎬＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０在Ｐ２Ｇ和Ｆ２Ｇ中均显著上调表达(图３Ｃ)ꎬ其注释功能为Ｙｃｆ２蛋白编码基因ꎬ该编码基因为被子植物中最重要的质体基因ꎬ与植物光合作用有关ꎮ３㊀讨论与结论化学ＥＭＳ诱变是人工创造突变体最常用的处理方式之一ꎬ叶片黄化是最常见的诱变表型[２２]ꎮ笔者所在课题组前期通过ＥＭＳ诱变西瓜种子ꎬ获得稳定遗传的西瓜叶片黄化材料ꎬ其整个生育期均可保持黄化状态ꎮ植物叶片黄化突变ꎬ又称叶绿素缺乏突变ꎬ通常是由叶绿素合成或降解途径被破坏所致[３８]ꎮ目前ꎬ研究者已经在水稻[３９]㊁番茄[４０]㊁黄瓜[１９]㊁拟南芥[４１]等植物中发现了黄化突变体ꎮ有研究发现ꎬ不同类型的叶色突变的遗传规律差异较大ꎬ有些叶色突变可能是核遗传ꎬ也可能是细胞质遗传ꎬ水稻[４２]㊁玉米[４３]㊁小麦[４４]㊁黄瓜[４５]㊁番茄[４６]等都由１对或２对隐性核基因控制ꎮＺｈａｎｇ等[２１]研究证实ꎬ西瓜叶片白化突变是由１对隐性等位基因(ｊａｊａ)控制的ꎮＰｒｏｖｖｉｄｅｎｔｉ[２０]发现ꎬ西瓜叶色斑驳突变由１对隐性基因(ｓｌｖ)控制ꎮＫｉｄａｎｅｍａｒｉａｍ等[３０ꎬ４７]发现ꎬ西瓜叶色后绿突变是由１个隐性基因(ｄｇｄｇ)控制的ꎮＺｈｕ等[２５]研究发现ꎬ西瓜黄化突变体ｗ￣ｙｌ由１对隐性核基因控制ꎬ与本研究结果一致ꎮ西瓜作为重要的园艺经济作物[４８￣５１]ꎬ在中国的栽培面积和产量均居世界首位ꎮ经长期人工选择ꎬ栽培西瓜遗传背景狭窄ꎬ多态性分子标记开发受限ꎬ致使西瓜分子标记辅助育种及品种改良进展缓慢ꎮ高密度遗传图谱的构建不仅是开发西瓜重要农艺性状遗传基因/ＱＴＬ紧密连锁分子标记的重要手段ꎬ亦是深入挖掘和解析西瓜重要农艺性状基因的基础ꎬ通过遗传图谱构建进行基因/ＱＴＬ定位研究已经在西瓜多种性状研究中得到成熟应用[５２￣５３]ꎮ本研究基于ＢＳＡ定位ꎬ将西瓜叶片黄化基因定位于２号染色上ꎬ为了进一步获得可靠定位基因ꎬ本研究开发了ＳＮＰ标记ꎬ用于构建高密度西瓜遗传图谱ꎬ并将西瓜叶片黄化基因定位到２号染色体１３９５０３０６~１５５１７５９１ｂｐ(大小约为１ ５６Ｍｂ)ꎬ比对西瓜参考基因组９７１０３ｖ２发现ꎬ在候选区段内包含２４个注释基因ꎬ１７个基因在叶片中表达ꎬ４个基因在黄叶与绿叶转录组分析中存在显著差异表达ꎬ其中基因Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０是Ｙｃｆ２蛋白的编码基因ꎬＹｃｆ２/ＦｔｓＨ调控的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸￣苹果酸脱氢酶是叶绿体或非光合质体在黑暗中产生腺嘌呤核苷三磷酸的关键酶[５４]ꎬ是光合生长必需的酶[５５]ꎮ目前ꎬＹｃｆ２基因已被证实是被子植物中最重要的质体基因[５６]ꎬ它在高等植物中发挥着重要功能[５７]ꎮ在本研究中ꎬ由于双亲重测序深度不高ꎬ候选区间注释基因编码区中未发现可靠突变ꎬ但转录组结果显示ꎬＹｃｆ２在叶片黄化西瓜材料中的表达量显著下调ꎬ说明叶片黄化西瓜材料的光合作用系统可能与正常绿叶植株光合系统存在显著差异ꎬ相关机制需要进一步研究ꎮ本研究结果可为进一步挖掘叶片黄化植株光合作用机制奠定一定科学基础ꎮ参考文献:[１]㊀陈婷婷ꎬ符卫蒙ꎬ余㊀景ꎬ等.彩色稻叶片光合特征及其与抗氧化酶活性㊁花青素含量的关系[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０２２ꎬ５５(３):４６７￣４７８. 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南方农业South China Agriculture第17卷第13期Vol.17No.132023年7月Jul.2023扦插是一种传统的植物无性繁殖方法，被广泛应用于林业和花卉种苗生产中。

当前国内外对扦插繁殖的研究主要集中在技术层面，对黄化处理促进扦插生根的综合评述较少。

基于此，本文就黄化处理的历史、方法、促进生根的原理和效果及应用情况进行总结。

1黄化处理的历史黄化处理是将整个植株或植株的一部分置于遮阴或完全黑暗的条件下，对生长发育期的母本进行扦插前预处理的过程。

黄化处理在植物无性繁殖中历史悠久。

根据文献记载，最早可以追溯到1537年[1]。

堆土压条、空中压条等都是黄化处理的具体操作。

1.1国外国外研究人员早在1537年就通过试验表明：对母株进行黄化处理，有利于插穗生根[1]。

20世纪20年代，黄化处理在众多木本植物中得到了广泛应用。

1937年，Gardner 在苹果扦插过程中发现，黄化枝条更易生根[2]。

试验人员在1970年通过黄化或弱光照处理，发现生长素和茶多酚具有协同作用[3]。

1978年，Nelson 报道黄化枝条中中柱鞘的形成减少[4]。

1982年，Herman 和Hess 报道，黄化枝条细胞分裂少，黄化作用可增加木槿和菜豆枝条中生长素协同物质的含量[5]。

近年来研究表明，黄化枝条生根率提高与形态学、生理学和分子的改变有关系。

1.2国内在我国，黄化处理对扦插生根的影响研究相对起步较晚。

最早有文献记载的是，周汉忠等于1966年在茶树扦插过程中，发现对母株黄化处理可以使插穗提前发根[6]。

20世纪90年代后，马锋旺证明了对枝条进行黄化处理可以明显提高生根率[7]。

此后，科技工作者对黄化枝条生理特性进行了深入研究。

卢楠等在对1年生四倍体刺槐硬枝的黄化处理中，测定了扦插后不同时间插穗的3种氧化酶活性和4种内源激素的质量分数，试验表明与未进行黄化处理的枝条相比，经过黄化处理的枝条生根质量明显提高；进一步证明，通过生长素和黄化插穗的结合，确实可以促进插穗形成不定根[8]。

惠林冲，陈　微，张仕林，等．洋葱黄色条纹突变体叶绿体基因组测序及嵌合体验证［Ｊ］．江苏农业科学，２０２３，５１（２０）：４３－４９．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２３．２０．００７洋葱黄色条纹突变体叶绿体基因组测序及嵌合体验证惠林冲，陈　微，张仕林，李威亚，何林玉，杨海峰，潘美红（连云港市农业科学院，江苏连云港２２２０００） 摘要：为鉴定洋葱黄条纹突变体中叶绿体基因组基因突变，利用洋葱黄色条纹突变体进行黄色组织叶绿体基因组测序及差异位点验证分析，对突变体种子果夹表型特征与出苗后表型进行对比分析，并利用ＡＢＰ１－１、ＫＭＯＸ－１和ＭＹＢ－２分子标记对４份黄条纹黄化程度在５０％以上的植株绿色和黄色组织ＤＮＡ进行分子标记多态性检测。

结果表明，测序获得突变体叶绿体基因组１５３５８５ｂｐ，与洋葱叶绿体参考基因组比对筛选出５个差异位点，ＰＣＲ扩增及测序分析发现叶绿体基因组碱基的突变、插入并不导致黄条纹突变；突变果夹黄化程度与母株上种子出苗后黄化程度成正比，果夹越黄，种子出苗叶片越黄，３个分子标记对同一株黄色和绿色组织进行ＰＣＲ验证，发现绿色与黄色组织扩增条带不一致。

综上所述，洋葱叶片黄色条纹突变是一种嵌合体突变。

关键词：洋葱；黄条纹；叶绿体；嵌合体；基因组测序 中图分类号：Ｓ６３３．２０１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２３）２０－００４３－０６收稿日期：２０２２－１１－３０基金项目：江苏省连云港市财政专项（编号：ＱＮＪＪ２２０６）；连云港市第六期“５２１工程”科研项目（编号：ＬＹＧ０６５２１２０２１３４）。

作者简介：惠林冲（１９８８—），男，江苏灌南人，硕士，助理研究员，从事蔬菜育种、栽培及分子生物学研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕｉｌｉｎｃｈｏｎｇ＠ｙｅａｈ．ｎｅｔ。

通信作者：潘美红，硕士，副研究员，从事蔬菜育种、栽培及利用研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：７９９１４５４＠１６３．ｃｏｍ。

水稻叶色突变体的光合和生理生化特性研究的开题报告
一、研究背景及意义
水稻是我国重要的粮食作物之一，近年来随着对水稻产量和品质要求的不断提高，新品种的选育变得越来越关键。

而叶色突变体则是一类变异营养性的重要材料，其在
光合、生长发育和逆境适应等方面均存在显著的生理和生化差异，因此对其进行深入
的研究有助于了解水稻的生长发育机制，提高育种效率，提高作物产量和品质，实现
粮食安全和农业可持续发展。

二、研究内容及方法
本研究选取数种水稻叶色突变体为研究对象，包括绿叶、黄叶和红叶等类型，比较其与普通绿色叶子水稻在光合和生理生化方面的差异，探究其叶色突变的遗传基础
和生理机制。

具体研究内容和方法如下：
1.测定叶片光合参数
选取变异营养性较为明显的突变体，测定其叶片的光合速率、净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度等参数，比较各类型水稻叶片的光合特性，并探究其差异的生理生化基础。

2.测定叶片生理生化参数
测定各类型水稻叶片的叶绿素含量、类胡萝卜素含量、蛋白质含量、可溶性糖含量、丙二醛含量等生理生化参数，比较其差异，并分析其在叶色突变机制中的作用。

3.基因定位和生物信息学分析
对发现的叶色突变基因进行基因定位，比较其DNA序列、蛋白质结构、功能等
差异，并利用生物信息学工具预测蛋白质功能和相互作用网络，解析其遗传基础和分
子机制。

三、研究预期成果
通过上述研究内容和方法，本研究预期能够深入了解水稻叶色突变体的光合和生理生化特性，并探究其差异的生理生化基础和分子机制，揭示其叶色突变的遗传基础
和生理机制，为水稻育种提供理论支持和实际应用价值。

2025年高考生物复习之小题狂练300题（解答题）：植物生命活动的调节（10题）一．解答题（共10小题）1．水杨酸是一种小分子酚类化合物，为探究水杨酸对植物根生长的影响，科研人员取适量品质均一的油菜种子，播到含不同浓度的水杨酸的培养基上培养，种子发芽13d后对油菜幼根的侧根数目和主根长度分别进行计数，结果如下表。

测定项目水杨酸浓度/（μmol•L﹣1）00.080.40 2.0010.00侧根数目（条）15.7016.7021.3016.6210.33主根长度13.6512.6911.719.017.48（cm）回答下列问题：（1）植物激素作为参与调节植物的生命活动。

基于以上信息，还需确认，可初步判断水杨酸也属于植物激素。

（2）据表分析可得：①水杨酸对油菜侧根发生的影响为；②主根处理组中出现，表明一定浓度范围内，水杨酸对主根伸长的抑制作用随浓度增加而增强。

（3）有研究发现，水杨酸对主根伸长的抑制作用会随着主根生长时间的延长而减弱。

在上述实验基础上设计实验进行验证，实验思路是，预期实验结果是。

（4）植物根的生长还受等环境因素的调节（至少答出2点）。

2．光敏色素是一类能接受光信号的分子，主要吸收红光和远红光，具有非活化态（Pr）和活化态（Pfr）两种类型。

农田中玉米—大豆间作时，高位作物（玉米）对低位作物（大豆）具有遮阴作用，严重时引发“荫蔽胁迫”，此时，低位植物体内的光敏色素及多种激素共同响应荫蔽胁迫。

请回答下列问题。

（1）光敏色素是一类（化学本质）。

在不同的光照条件下，光敏色素接受光信号后，会经过信息传递系统传导至细胞核内，影响，从而表现出生物学效应。

（2）自然光被植物滤过后，其中红光（R）/远红光（FR）的值会下降，原因是。

发生荫蔽胁迫时，低位植物体内的光敏色素主要以形式存在。

此形式的光敏色素可（选填“减弱”或“增强”）对光敏色素互作因子（PIFs）的抑制作用，有利于多种激素共同响应荫蔽胁迫。

中国蔬菜 2010（14）：31-35CHINA VEGETABLES番茄叶色黄化突变体的遗传分析及SSR分子标记郭 明 张 贺 李景富*（东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030）摘 要：在番茄普通栽培品种中蔬4号06884中发现能稳定遗传的叶色黄化突变体06883，该突变体新出叶最初为绿色，四叶一心时第一片真叶开始转黄，果实转色慢，硬度大耐贮藏。

通过该突变体和栽培品种中蔬4号的正反交试验的遗传分析证明，该突变材料的叶片黄化性状由1对隐性主效核基因控制，该性状可以用来作为指示性状鉴定杂种纯度。

应用SSR分子标记技术对该突变基因进行初步定位，经连锁分析表明，该基因与LEaat006、LEtat002和Tom196-197连锁，与它们的连锁距离分别为8.9、16.3和18.7 cM。

关键词：番茄；叶色黄化突变；SSR；基因定位中图分类号：S634 文献标识码：A 文章编号：1000-6346（2010）14-0031-05 Genetic Analysis and SSR Molecule Marker on Tomato Yellow Leaf MutantGUO Ming, ZHANG He, LI Jing-fu*（College of Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China） Abstract：A natural yellow leaf mutant named 06883, found in tomato（Lycopersicon esculentum Mill.）variety‘Zhongshu No.4’, can be inherited stably. Originally the leaves were green, but the first true leaf color turned into yellow during the period of four leave and one shoot. The fruits turned to red slowly, and became hard which is good for storage. The mutant was reciprocally crossed with tomato variety ‘Zhongshu No.4’, and the genetic analysis indicated that the mutant is nucleolus inheritance and controlled by one recessive gene. It can be used as a phonotypical marker to identify purity of F1 hybrids. We roughly mapped the mutant gene using SSR molecular markers. Three SSR markers LEaat006, LEtat002 and Tom196-197 were linked to the mutant gene. They were 8.9 cM, 16.3 cM and 18.7 cM apart from the mutant gene, respectively.Key words：Tomato; Yellow leaf mutant; Simple sequence repeat（SSR）marker; Molecular mapping叶色突变是自然界比较常见的一种突变，由于突变基因往往是直接或间接影响叶绿素的合成和降解，改变叶绿素含量，所以叶色突变体也称为叶绿素突变体（何冰 等，2006）。

一个新的黄瓜叶色黄化突变体的生理特性分析李万青;高波;杨俊;陈鹏;李玉红【摘要】叶色黄化突变体是开展光合系统的结构和功能、叶绿素生物合成及其调控机制研究的理想材料.以叶色黄化突变体(C528)及其野生型(CCMC)为材料,对其光合色素质量分数、光合作用指标和抗氧化酶活性进行研究,并初步调查突变体的农艺性状.结果表明,突变株C528从子叶期开始表现出叶片黄化,叶片的黄化性状不随发育而转变,其株高、茎粗等显著小于野生型;光合色素质量分数及净光合效率(Pn)显著低于野生型;通过对保护酶活性及丙二醛质量摩尔浓度等指标的测定,结果表明,SOD、POD和CAT活性及丙二醛(MDA)质量摩尔浓度均高于野生型.此研究结果可为阐明黄瓜叶色黄化突变机理及图位克隆突变基因提供基础资料.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2015(024)007【总页数】6页(P98-103)【关键词】黄瓜;叶色黄化突变体;光合特性;抗氧化酶活性;丙二醛质量摩尔浓度【作者】李万青;高波;杨俊;陈鹏;李玉红【作者单位】西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S642.2植物叶色变异是一种常见的突变性状，而叶色突变基因常常直接或间接影响叶绿素的合成与降解，从而改变叶绿素质量分数，所以植物叶色突变体有时也称为叶绿素突变体。

在育种工作中，叶绿素突变体可作为标记性状，在苗期剔除影响种子纯度的植株，不但能简化良种繁育过程也能够提高种子纯度；利用叶色突变体可选育优良的种质资源［1］。

在基础研究中，叶色突变体是开展植物光合作用机制、光形态建成、叶绿体结构功能与遗传发育调控机理等研究的理想材料［2－5］，利用突变体对分析鉴定基因功能，了解基因间互作、基因表达调控等机制均具有重要理论意义。

两个水稻叶色突变体的鉴定和基因定位的开题报告一、研究背景：水稻（Oryza sativa L.）是我国重要粮食作物之一，是我国主要的食品作物之一，也是世界上最重要的粮食作物之一。

随着人口的增加和生活水平的提高，对水稻的需求也在不断增加。

因此，提高水稻产量和品质，以满足人们需求，已成为目前水稻育种的主要研究方向之一。

水稻的叶色是水稻生长发育过程中的一个重要指标，也是水稻叶绿素合成和代谢的反应之一。

然而在育种过程中，有时会出现水稻叶色发生突变的情况，这可能对水稻的生长发育和产量产生负面影响。

因此，对水稻的叶色突变体进行鉴定和基因定位，对于深入了解水稻的叶色形成机理，提高水稻品质和产量具有重要意义。

二、研究目的：本研究旨在对两个水稻叶色突变体进行鉴定和基因定位，以研究其叶色形成机理和对水稻生长发育和产量的影响，为水稻育种提供理论依据和实践经验。

三、研究内容：1. 对两个水稻叶色突变体进行外观观察和鉴定，分析其叶绿素合成和代谢的差异；2. 利用基因组学、遗传学、生物化学等方法对这两个突变体的基因进行定位和功能鉴定，探究其叶色形成机理；3. 对比分析这两个突变体与野生型水稻在形态、植株生长和发育、生理生化特性、农艺性状等方面的异同；4. 在不同生态条件下对这两个突变体的生长发育和产量进行场试，验证其对水稻生长发育和产量的影响；5. 对这两个突变体的遗传育种利用进行探讨，为水稻育种提供理论依据和实践经验。

四、研究意义：1. 探究水稻叶色形成的机理，对水稻育种具有重要意义；2. 鉴定和基因定位水稻叶色突变体，可以为深入了解水稻叶色形成机理提供新的思路和方法；3. 研究水稻叶色突变体对水稻生长发育和产量的影响，可以为水稻育种提供理论基础和实践经验；4. 在育种过程中利用这两个突变体，可以加速水稻优异品种的选育和培育。