基因诊断与产前诊断中常用的分子生物学技术

分子生物学技术在基因诊断中的应用随着科学技术的飞速发展和基因研究的深入推进，基因诊断技术愈发成熟和完善，分子生物学技术也逐渐成为了基因诊断的重要方法之一。

分子生物学技术所具有的高效、高灵敏度和高特异性等特点，使其成为了基因诊断的重要手段，被广泛应用于基因相关疾病的诊断、筛查和治疗等方面，为人类健康事业做出了重要贡献。

一、分子生物学技术在基因诊断中的概念分子生物学技术主要是应用于研究物种遗传机制、基因表达调控、蛋白质结构和功能以及细胞分子机制等方面的技术手段。

而在基因诊断中，主要应用的是PCR技术、DNA测序技术、基因芯片技术和核酸杂交技术等。

1、PCR技术PCR技术，即聚合酶链式反应技术，是通过特定引物和热稳定的DNA聚合酶，对DNA片段进行大量扩增，并在扩增过程中进行定量、分型和序列检测等操作的一种技术手段。

PCR技术在基因诊断中主要应用于单基因遗传性疾病的检测、突变分析、基因多态性检测和分型等方面。

2、DNA测序技术DNA测序技术，即基因组测序技术，是通过对DNA片段进行全基因组或部分基因组的高通量测序技术，获取基因组DNA的全面信息，筛查潜在基因变异、诊断稀有疾病和进行基因组学研究等方面。

DNA测序技术在基因诊断中主要应用于遗传性疾病的突变分析和基因检测等方面。

3、基因芯片技术基因芯片技术，即基因芯片微阵列技术，通过将已知基因序列或变异数据存储在芯片上，将物种的基因信息快速获取和分析。

基因芯片技术在基因诊断中主要应用于基因突变和多态性检测、癌症基因的筛查和诊断以及基因表达谱的分析等方面。

4、核酸杂交技术核酸杂交技术，即Southern blotting技术，是通过DNA片段的特异性杂交，检测特定序列的存在和变异情况的一种技术。

核酸杂交技术在基因诊断中主要应用于基因探针的制备、分析和检测，特别是在遗传性疾病和癌症基因的诊断和研究方面发挥了重要的作用。

二、分子生物学技术在基因诊断中的实际应用分子生物学技术在基因诊断中的实际应用极为广泛，主要表现在以下几个方面：1、单基因遗传性疾病的检测和分型单基因遗传性疾病是由单个基因突变所导致的遗传性疾病，如先天性耳聋、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和先天性遗传异常等。

基因诊断作者：陈志宁来源：《新一代》2011年第05期摘要：基因诊断是通过分子生物学和分子遗传学的技术，用标记的DNA（或RNA）片段做探针，应用核酸分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，从而对疾病做出判断。

探针必须是只与目标DNA序列杂交的高度特异性的DNA（或RNA）片段。

基因组中碱基的变化可能导致限制酶酶切位点的消失或新的酶切位点的出现，从而使限制酶酶解获得的限制性片段（RF）的长度和数目发生改变。

根据RF与探针杂交后的图谱可进行产前诊断。

关键词：核酸分子杂交；基因探针；变性；限制性片段；产前诊断中图分类号：G620 文献标识码：A 文章编号：1003-2851（2011）05-0188-02基因作为生命的物质基础，其结构和功能的改变会导致表型改变，因而探查基因的状态有可能对疾病作出诊断，这种在基因水平上对疾病进行诊断就叫基因诊断，又叫分子诊断或DNA诊断。

基因诊断检测的疾病主要有3大类：感染性疾病的病原诊断、恶性肿瘤的诊断、遗传病的基因异常分析。

一、核酸分子杂交原理互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交，这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA 之间进行。

因此，当用一段已知基因的核酸序列经标记制成探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而在被检测基因组DNA中找到目的基因。

特异的DNA探针与被检基因组DNA都变性呈单链状态时就能进行分子杂交。

二、基因探针2.1基因探针携带基因的遗传信息，是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列经标记制成。

可以为基因的全部，也可以是基因的一部分；可以是DNA，也可以是由DNA转录来的RNA。

2.2探针来源①基因组探针：来自基因组中有关的基因本身②cDNA探针：从相应的基因转录获得的mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNA 探针。

产前诊断中的基因检测四川省妇幼保健院生殖中心；四川省计划生育科研所遗传室李运星以简炼的方式介绍产前诊断基因水平诊断的技术方法，并加以常见的病例给予说明，值得基层的产前诊断与优生优育工作者一阅。

基因检测在产前诊断中是十分重要，且正在不断发展与完善，其实质是在DNA水平或RNA水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。

基因诊断始于1978年，美国科学家首先将限制性片段长度多态性（RFLP）用于基因诊断，从而揭开了基因诊断的序幕，基因诊断不仅可以明确指定个体是否患病，存在基因缺陷并揭示基因状态，而且可以对表型正常的携带者、对某种疾病的易感者作出诊断和预测。

分子遗传检测技术大致可分为酶谱分析法、聚合酶链反应（PCR）、探针杂交分析法、DNA测序等方法。

实际上，临床上多将这几种技术联合应用于基因检测。

一、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）人群中不同个体基因的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。

DNA顺序上发生变化而出现或丢失某一限制性内切酶位点，使酶为RFLP。

任何一个基因内切大片段的缺失、插入以及基因重排，即使不影响到限制性内切酶位点的丢失或获得，也很可能引起限制酶片段的大小和数量发生变化，因而这类基因突变可以通过限制性内切酶DNA或结合基因探针的杂交方法将突变找出。

例如1.镰形红细胞贫血症的基因诊断：已知镰形红细胞贫血症的突变基因是编码β珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG，可用限制性内切酶MstⅡ进行检测。

因为这一突变使正常存在的MstⅡ切点消失，这就使正常情况下存在的1.1kb及0.2kb条带变成患者（纯合子）的1.3kb条带。

2.血友病A的诊断血友病A是一种X连锁隐性遗传病。

用VⅢ因子基因的cDNA片段作为探针对待检者DNA酶切片段进行杂交，就可检出VⅢ因子基因部分缺失的男性患者和女性携带者。

下图家系Ⅲ-1患有严重的血友病A，经VⅢ因子治疗后产生VⅢ因子抑制物。

1、携带者(carrier)是指表现型正常，但携带有致病遗传物质的个体。

其体指：①携带有隐性致病基因，本人表现正常的个体；②携带有显性致病基因，但没有外显的正常个体；③携带有致病基因，迟发个体；④染色体平衡易位或倒位的个体。

2、系谱分析(pedigree analysis)家系分析是一诊断遗传疾病的重要步骤，根据系谱图，对家系进行回顾性分析，以便确定所发现的某一特定性状或疾病在这个家族中是否有遗传因素的作用及其可能的遗传方式。

3、产前诊断（prenatal diagnosis)产前诊断称为宫内诊断，是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形做出准确的诊断。

4、绒毛取样法（chorionic sampling）绒毛取样法又称为绒毛吸取术，是通过特制的取样器，经孕妇阴道、宫颈进入子宫，达到胎盘处后吸取一定数量的胎儿绒毛组织。

5、基因诊断(gene diagnosis)应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出的或辅助临床诊断的技术，称为基因诊断，又称为分子诊断。

6、聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)它是模拟体内条件卜应用DNA酶反应特异性扩增某一DNA片段的技术。

7、遗传标志(genetic marker)所谓遗传标志是群体中存在多态性而遗传上遵循孟德尔规律的，同时不受环境影响而改变的特征物，如染色体上的某些结构、HLA类型以及特征性的DNA序列等。

8、核酸杂交(nuclear hybridization)是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。

其原理是核酸变性和复性理论。

即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。

9、基因芯片技术(gene chip technique)基因芯片技术是大规模、高通量分子检测技术。

将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，形成矩阵点。

干货了解！产前筛查与产前诊断的重要性对于一些在备孕期间或者是处于妊娠阶段的女性，为了保护身体的健康，也为了避免一些遗传疾病情况的发生，需要注意配合医生做好产前筛查与产前诊断，这样才可以避免胎儿有畸形的情况，也可以减少对女性身体造成的影响。

一、什么是产前筛查？产前筛查指的是对胎儿畸形的筛查，这包括早孕期或中孕期通过血清学和超声检查等来预测胎儿患有唐氏综合征和其他染色体异常的风险（早唐、中唐、超声软标志物等），以及在中孕期通过超声进行胎儿结构异常的“大畸形筛查”，也叫“大排畸”。

无创胎儿DNA检查（NIPT）也是属于筛查，是高级筛查，不是诊断。

二、什么是产前诊断？产前诊断指的是对高风险的胎儿进行进一步的确诊检查，例如对唐氏筛查高风险，NIPT高风险，不良孕产史，遗传性疾病家族史的孕妇进行检查。

可以采用绒毛膜活检，羊膜腔穿刺，脐带血穿刺等侵入性方法获取胎儿组织进行细胞遗传学和分子遗传学的检查。

产前诊断以往主要指的是对染色体异常的诊断，现在也扩展到对胎儿结构异常的影像学诊断，超声检查既可以是筛查，也可以是诊断，另外一种常用的影像学诊断是胎儿的磁共振（MRI）检查。

三、产前筛查与产前诊断的区别？产前筛查针对的是所有的孕妇，目的是筛查出高风险的胎儿和母亲。

针对高风险的人群的检查不叫筛查，筛查指的是全覆盖的健康人群。

产前诊断的目的是确诊，针对的是筛查高风险或者是有不良的孕产史或家族史的孕妇。

一般情况下，产前筛查是无创性的，侵入性的产前诊断方法会有小概率的胎儿丢失。

四、哪些孕妈需要产前诊断呢？1、高龄孕妇(年龄＞35岁)；2、不良生育史的孕妇，如生育过先天性畸形、无脑儿、先天愚型以及其他染色体异常患儿等的孕妇；3、有反复流产、难孕、不能解释的围产期死亡史的孕妇；4、夫妇一方是染色体平衡易位携带者；5、有家族性遗传疾病史或夫妇一方患有遗传疾病的孕妇；6、羊水过多或过少；7、孕期有可疑病毒感染的孕妇；8、孕期使用有致畸药物如抗肿瘤药物、孕激素等的孕妇；9、孕早期存在有害物质接触史如大剂量放射线、有害气体等病史；10、患有慢性疾病的孕妇，如胰岛素依赖性糖尿病、癫痫、甲亢、自身免疫性疾病、慢性心脏病、肾脏病等；11、产前母血筛查高危者，如先天愚型或ntd（胎儿开放性神经管畸形的风险）高危孕妇。

什么是分子诊断分子诊断指的是通过分子生物学检测方法诊断机体中某些遗传物质的方式。

在临床医学领域，分子诊断学的应用非常广泛，其检查结果相对精准且快速。

比如说，分子诊断方式可以应用于产前诊断中，主要检测人体结构中的蛋白、酶、抗原、抗体等基因。

除此之外，分子诊断技术也可以检测出人体的传染性疾病，对影响药物的变异性基因进行鉴别，还可以检测出与癌症有关的基因。

分子诊断必须在符合规定条件的实验室内进行，目的是保证最终的检测结果有效且可靠。

人们可以通过分子诊断发现潜在的基因疾病风险，从而更早的做出风险管理准备，避免疾病发生或加重。

分子诊断也能筛选出更加有效的药物对人体进行治疗，提升医疗质量与效率。

图1即为分子诊断相关内容。

图1一、分子诊断技术分类第一，PCR技术。

PCR技术就是基因扩增技术，其利用了DNA的变性原理与复性原理，通过适温延伸、高温变性和低温复性，使得核酸片段体外扩增，可以将非常少的目标DNA特异的扩增上百万倍，然后分析和检测DNA分子。

整体而言，基因扩增技术灵敏度较高且具有特异性，应用时简便快速，所以已经成为临床基因扩增实验室应用较多且接受程度最高的技术，包含定量PCR和常规PCR。

第二，分子杂交技术。

分子杂交技术的原理是，将两条同源序列核酸单链经过碱基互补配对之后结合形成双链的过程。

该技术可以借助已知序列的基因探针捕获和检测目标序列。

所以杂交双方包含探针与有待探测的核酸，比如基因组DNA或细胞总DNA，可以提纯也可以进行细胞内杂交。

一定要标记探针，然后才可以进行示踪与检测。

分子杂交技术灵敏度高且特异性高，目前多应用于克隆基因的筛选、基因组中特定基因序列的定性、定量检测等。

第三，基因测序技术。

基因测序技术是分子诊断技术的重要分支，能够直接获得核酸序列信息，且是唯一的技术手段。

目前，分子杂交与分子构象变异或定量PCR技术得到了良好发展，但在核酸鉴定方面依然处于间接推断假设阶段，所以特定基因序列检测的分子诊断依然以核酸测序为金标准。