文 ⊙ 周远成 畜禽生物制品四川省重点实验室 张 冰 四川华神兽用生物制品有限公司
李 碧 四川农业大学动物医学院
2011年至今，全国范围内的猪伪狂犬病暴发后，国内学者分离到大量新毒株，如HeN1及TJ株。基因组分析结果表明，新毒株与以往分离的PRV毒株相比存在转换、插入和缺失变异的特点。实验结果证实SA215对伪狂犬病经典毒株和新流行毒株均具有优异的免疫保护能力，能有效保护猪只免受猪伪狂犬病野毒的感染。
猪伪狂犬病活疫苗（SA215株，扑伪优）
对新流行伪狂犬病病毒具有良好的免疫保护力
2011年底河南、山东等地先后暴发猪伪狂犬病，随后迅速扩散至我国主要生猪养殖区域，给养猪业造成了巨大的经济损失。为了研究猪伪狂犬病活疫苗（SA215株）对新流行猪伪狂犬病病毒的免疫效力，本研究对猪伪狂犬病活疫苗SA215株和新流行伪狂犬病野毒株的主要免疫保护相关基因进行遗传进化分析，使用断奶仔猪模型评价猪伪狂犬病活疫苗SA215株对猪伪狂犬病病毒和新流行毒株的免疫效力。结果显示，猪伪狂犬病病活疫苗SA215株与流行毒株均为基因II型毒株，而我国广泛使用的疫苗毒株Bartha株则为基因I型。使用SA215株免疫仔猪后1周即可检测到gB抗体，免疫后4周分别使用流行毒株SCHS株和经典毒株Fa攻毒，结果显示，未免疫攻毒的对照组全部发病、死亡，而免疫组未观察到伪狂犬病的临床症状。
伪狂犬病病毒（Psudorabies Virus，PRV）为疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科成员，基因组为线状双股DNA，核酸长度约150kb。PRV可感染多种动物（35种以上），以发热、奇痒（猪除外）、繁殖障碍、呼吸道症状和脑脊髓炎为特征。猪是PRV最主要的天然宿主，PRV感染后的临床症状与猪的年龄、免疫状态以及毒株毒力密切相关，通常情况下易感猪群年龄越小感染后发病率和死亡率越高。PRV可以在神经细胞内复制并沿神经通路传导，猪感染恢复后PRV可以潜伏在三叉神经节中而不被机体清除，在猪免疫力下降或环境应激条件下，潜伏的PRV可被激活持续在猪体
内复制并排出病毒。目前欧美发达国家已经成功根除该病，而PRV一直在我国猪群中流行，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。
2011年底，猪伪狂犬病首先在我国北方地区暴发，以繁殖障碍和育肥猪gE抗体快速转阳为主要特征。国内科研院所在疾病暴发后对该病进行了大量的研究，先后分离到多个新毒株，如HNX、ZJ01、HeN1、SMX、TJ、JS、HN1201、XJ、FJ和SCHS株等。进一步研究发现，新毒株可感染Bartha免疫猪群并造成严重的经济损失；新流行毒株传播能力强于经典野毒株，在某些猪场种猪或育肥猪gE抗体阳性率甚至达到100%。遗传进化研究结果显示，新流行毒株均为基因II型毒株，而我国广泛使用的疫苗株Bartha株则为基因Ⅰ型毒株。
疫苗免疫是防控猪伪狂犬病最经济的方法。猪伪狂犬病活疫苗SA215株是我国第一个具有完全自主知识产权的动物病毒基因工程活疫苗，开创了我国动物病毒基因工程疫苗实用化的先例。运用基因工程技术，SA215缺失了亲本毒Fa的主要毒力基因gE、gI、TK。经过生物学特性、免疫原性、遗传稳定性和安全性试验等一系列研究证实，SA215株在防控猪伪狂犬病上具有免疫原性好、安全性高、能阻止强毒入侵中枢神经等优势，可区分疫苗和野毒感染。为评价猪伪狂犬病活疫苗SA215株对新流行毒株的免疫保护效力，本研究通过遗传进化分析和免疫效力测试发现SA215与我国当
前流行毒株均为基因II型毒株，能够为仔猪提供良好的免疫保护力，保护仔猪免受经典伪狂犬病病毒和新流行毒株的感染。
1 材料与方法
1.1 毒种、细胞与抗体检测试剂盒
猪伪狂犬病毒Fa株（103.0LD50/mL）、猪伪狂犬病活疫苗SA215株（105.0TCID50/mL）由四川华神兽用生物制品有限公司提供；猪伪狂犬病病毒SCHS株（103.0LD50/mL）由畜禽生物制品四川省重点实验室分离、鉴定和保存，SCHS株分离于2013年，来源于四川某免疫Bartha疫苗毒株的发病猪场。猪伪狂犬病gB 抗体检测试剂盒购自美国IDEXX公司。
1.2 试验动物
断奶仔猪20头，系经猪伪狂犬病病毒检测为阴性（中和抗体效价均≤1∶4），且体重相近、经临床检查均处于健康状态的DLY（杜洛克×长白×约克夏）仔猪，由四川华神兽用生物制品有限公司提供，并严格在隔离条件下饲养。
1.3 动物设施及说明
四川华神兽用生物制品有限公司负压试验动物房，动物试验许可证号：SYXK(川)2014-039。动物实验严格遵守国家相关动物操作的相关规定。
1.4 PRV gD基因遗传进化树的构建
登录N C B I G e n b a n k数据库下载S A215株（DQ367438.1）和所有伪狂犬病病毒的gD基因序列，利用生物学软件MEGA 6.0进行序列比对后运用“Neighbor-Joining Method”算法构建遗传进化树，分析gD基因的进化特征。
1.5 接种与攻毒
20头仔猪随机分为4组，每组5头。第1组和第3组肌肉注射SA215疫苗2mL/头（1头份），第2组和第4组作为对照组肌肉注射疫苗稀释液2mL/头。免疫前和免疫后7、14、21和28d分别采集血清测定gB抗体，并在接种后28d后用猪伪狂犬病病毒SCHS株和参考毒Fa株攻毒。攻毒方式和剂量如下：第1-2组滴鼻感染PRV SCHS株2mL/头；第3-4组滴鼻感染PRV Fa株2mL/头。
1.6 体温测定与症状记录
猪伪狂犬病病毒SCHS株和参考病毒Fa株攻毒后应观察14d，每日上午、下午各测肛温一次，实时观察并记录仔猪的体温精神食欲情况，是否出现咳嗽、喘气、呼吸急促和打喷嚏等呼吸道症状，以及转圈、撞墙、肌肉震颤、犬坐和泳状姿势等神经症状。
2 结果
2.1 gD基因序列分析
对Genbank中所有收录的猪伪狂犬病病毒gD基因序列分析发现，SA215株与其他科研院所分离的新流行毒株同源性均在99.5%以上。与国内2012年分离的新变异株TJ株只有两个氨基酸存在变异，分别是L/P （75）、D/A（94)，而Bartha与SA215和TJ同源性分别为96.5%和97%。在69、75、82、94、202、209、212、286、307、340、343和393位点突变，278、279缺失2aa。遗传进化分析显示所有伪狂犬病病毒可以分为两个分支，分别为基因Ⅰ型和基因II型，SA215与国内分离的毒株均为即基因II型毒株，而Bartha疫苗株和国外大部分流行毒株则为基因Ⅰ型毒株（图1）。
图1 PRV gD基因的进化树
注：图中所有序列均以序列号和毒株名字命名。
2.2 免疫效力测试结果
仔猪免疫SA215后，分别在免疫前和免疫后不同时间点采集血清测定gB抗体，结果显示免疫后7d所有免疫仔猪抗体转为阳性，而对照组在攻毒前均为阴性
