病毒感染的实验诊断

病毒感染的实验诊断

● 考点

病毒的生物学性状

病毒的实验室检查方法

常见病毒的感染

【内容讲解】

第一节 概述

一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。

仅含一种核酸作为遗传物质，外被蛋白质衣壳或还有包膜。

病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。

在临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。

一、病毒的基本性状

（一）形态结构

1.大小和形状：

大小：测量单位用纳米表示，一般在20-300nm之间。

形态大致可分为：球形或近似球形、杆状、弹形、砖形、蝌蚪形等。

2.结构

（二）病毒的增殖

病毒必须依赖宿主细胞，

以特殊的自我复制方式进行增殖。

病毒的复制周期：

吸附、穿入、脱壳、生物合成、

组装与成熟、释放6个阶段。

异常增殖：

顿挫感染：病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能合成本身的成分或不能组装和释放有感染性的病毒颗粒。

缺陷病毒：由于病毒基因组不完整或基因位点改变而不能进行正常增殖的病毒。

干扰现象：当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象。

（三）噬菌体

以细菌、真菌等为宿主，能引起细菌等裂解的病毒。

噬菌体特异性识别细菌表面受体，可用于进行细菌的鉴定与分型。

噬菌体感染细菌后产生两种后果：

溶菌周期和溶源性周期。

（四）非寻常病毒

比病毒更小更简单的致病因子，又称为亚病毒因子，包括类病毒、卫星病毒和朊粒等。

朊粒个体微小，不含核酸，其主要成分是一种蛋白酶抗性蛋白，对各种理化作用的抵抗力强，具有传染性，是引起传染性海绵状脑病的病原体。 朊粒致中枢神经系统退化性病变，引起牛海绵状脑病（疯牛病）。克雅病（CJD）和Kuru病被认为与朊粒感染有关。

二、病毒的分类与命名

科、属、种3级或科、亚科、属、种4级。

DNA病毒、RNA病毒、DNA和RNA逆转录病毒三大类。

按传播途径可分为呼吸道病毒、胃肠炎病毒、经性传播感染的病毒等。

按感染部位与症状特征可分为肝炎病毒、出血性热病毒、疱疹病毒等。

第二节 病毒感染的实验诊断

病毒学实验室诊断有三个方面：

①直接检测和分离鉴定；

②检测病毒蛋白抗原成分和核酸；

③检测抗体。

一、标本采集、运送及处理

（一）标本采集

1.采样时机：应在病人急性期或发病初期采集标本。

2.标本种类：

根据不同病毒感染采集不同标本，如鼻咽分泌物、脑脊液、血液、粪便等。

（二）标本的运送及保存

快速传递，立即处理和接种。

采集和运送过程注意冷藏。如不能立即处理和接种，可在4℃保存数小时，长时间保存需置-70℃。

（三）标本处理

凝固的血液需先离心，得到的血清可以用于病毒分离。

肝素抗凝全血、脑脊液、胸腔液、水痘液以及尿液均可直接用于病毒分离培养。

有些标本如粪便等,常需粗提、提纯和浓缩等复杂处理过程。

二、分离培养与鉴定

（一）分离培养

1.组织培养 包括器官培养、组织块培养和细胞培养。

目前常用的方法是细胞培养；

常用细胞：

①原代和次代细胞培养；②二倍体细胞株；③传代细胞系。

2.鸡胚接种 一般选用9-12日龄鸡胚。

鸡胚中的部位 适宜病毒

卵黄囊 嗜神经病毒，如乙型脑炎病毒

羊膜腔 流感病毒

尿囊腔 流感病毒、腮腺炎病毒，还可制备疫苗和大量病毒抗原

绒毛尿囊膜 天花病毒、单纯疱疹病毒

脑内 狂犬病病毒

3.动物接种

实验室常用新生小鼠或乳鼠进行病毒分离。

（二）病毒鉴定

1.初步鉴定 根据临床症状、流行病学特点、标本来源、易感动物范围、细胞病变特征及生物学特征、理化性质可初步判断病毒的科及属。

2.最终鉴定 在初步鉴定的基础上，选择适当的血清学方法对病毒分离株进行最后鉴定，常用中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、免疫荧光试验、酶免疫试验等。分子生物学方法也在病毒鉴定方面得到应用。

初步鉴定（举例）：

细胞病变效应（CPE）：

细胞形态变化 病毒

细胞圆缩，分散，不聚集，全部细胞被破坏 肠道病毒

细胞肿大，颗粒增多，病变细胞聚集呈葡萄状 腺病毒

细胞融合成多核细胞 副粘病毒，疱疹病毒

空泡状，多核巨细胞 麻疹病毒

脂溶剂敏感实验：有包膜（+），无包膜（-）；

耐酸实验：肠道病毒（R），鼻病毒（S）。

三、病毒感染的诊断

（一）显微镜检查

1.用光学显微镜直接检查病毒包涵体。可作为病毒感染的辅助诊断，不是特异性试验。

核内包涵体：常见DNA病毒。如巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒和腺病毒等。

胞浆内包涵体：常见RNA病毒。如呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒和痘类病毒等。

胞质内和胞核内包涵体：麻疹病毒等。

2.用电子显微镜直接检查病毒颗粒。

数小时即可从病毒形态上作出明确的鉴别诊断。

应用免疫电镜灵敏度更高。

（二）病毒抗原检查

利用特异性免疫血清检测标本中的病毒抗原。

常用方法有：免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫法、反相间接血凝和对流免疫电泳等方法。

对于一些血清型别不多或在一般细胞培养系统中尚不能成功增殖的病毒，直接检测病毒抗原是快速而实用的方法。

（三）病毒抗体检查

利用特异性抗原检测病毒感染者血清中的IgM和IgG抗体。

常用的方法有中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验及免疫扩散等，还可以利用放射免疫法及酶联免疫吸附法。

IgM抗体出现在病毒感染的早期，所以标本采集时间对检测结果的影响很大。

IgG抗体检测需采集感染急性期与恢复期双份血清，恢复期IgG效价必须比急性期增高4倍或4倍以上时，才有诊断意义。

（四）病毒核酸检测 利用核酸杂交和PCR技术检测病毒特异基因片段。

检出病毒核酸并不等于检出具有传染性的病毒颗粒。

第三节 各类病毒感染的简介

一、呼吸道病毒 六、疱疹病毒

二、肠道病毒 七、肝炎病毒

三、急性胃肠炎病毒 八、反转录病毒

四、黄病毒 九、狂犬病病毒

五、出血热病毒 十、人乳头瘤病毒

一、呼吸道病毒

（一）流行性感冒病毒

（二）副流感病毒

（三）呼吸道合胞病毒

（四）腺病毒

（五）麻疹病毒

（六）风疹病毒

（七）冠状病毒

（一）流行性感冒病毒

1. 生物学性状

（1）形态：具有多形性，一般为球形或丝状，丝状多见于新分离株，感染性较强。

（2）结构：

（2）分型与变异

1）分型：根据核蛋白抗原和M蛋白的不同，将流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）型；

甲型流感病毒根据NA和HA的抗原性不同又分为若干亚型。

2）变异：变异的物质基础是HA和NA。

抗原变异幅度小时称为抗原漂移；

变异幅度大形成新的亚型，引起大规模流行，为抗原转变。 （3）培养特性：

常用鸡胚接种培养，初次分离接种羊膜腔为最佳，传代适应后可移种尿囊腔。

细胞培养一般用原代猴肾细胞（PMK）或犬肾传代细胞（MDCK）。

利用红细胞凝集试验确定病毒的存在。

（4）抵抗力：

不耐热，对干燥、日光、紫外线以及甲醛、乙醇等均敏感。

2.微生物检验

（1）标本采集和处理：

在发病急性期，以前3天为最好。

采集鼻腔洗液、咽拭子、鼻拭子等，置于Hanks液中。

放入冰壶中，速送实验室。若48小时内未能进行接种，标本应放于低温中保存。

（2）分离培养与鉴定：

标本接种于鸡胚羊膜腔，35℃3天后，收集羊水和尿囊液进行血凝试验并测定滴度。

血凝阳性者，用已知抗体作血凝抑制试验进行鉴定。

若血凝阴性时，需用鸡胚盲传1～2次，仍不出现血凝阳性者，方可判断病毒分离阴性。

也可接种原代猴肾细胞（PMK）或犬肾传代细胞（MDCK）。

（3）快速诊断

1）免疫荧光技术和酶免疫技术。

2）分子杂交技术。

3）PCR技术。

4）免疫电镜技术。

（4）血清学诊断：

需同时检测急性期（5天以内）和恢复期（2～4周）血清，在相同条件下进行血凝抑制试验，如恢复期抗体效价比急性期高4倍或4倍以上即有诊断意义。

3.临床意义

病毒随飞沫传播进入易感者呼吸道，依靠血凝素与黏膜柱状上皮细胞相应受体结合，感染细胞。

主要在呼吸道柱状上皮细胞内复制增殖，很少入血，但代谢毒素样物质可进入血流引起发热、头痛和全身酸痛。

甲型流感可以是散发，也可以是全球性大流行。乙型流感的播散速度及范围不如甲型。

（二）副流感病毒

1.生物学性状

属副黏病毒科、副黏病毒亚科、副黏病毒属。

形态结构类似流感病毒，但体积较大，其核酸为单负股RNA，不分节段。

包膜上嵌有两种糖蛋白刺突：

HN：具有血凝和神经氨酸酶活性，具有流感病毒HA的吸附作用；

F：具有使病毒进入宿主细胞和使病毒在宿主细胞之间传播的作用。

抵抗力弱，不耐酸，对热敏感。

2.微生物学检查

（1）标本采集和处理：采集发病早期标本，成人可采取鼻咽分泌物及咽嗽液标本，年幼患者可用咽拭子涂咽后壁，然后放入2ml收集液中，搅拌后，立即接种细胞。

（2）分离培养：最敏感的细胞是原代人胚肾和原代猴肾细胞，增殖并形成多核巨细胞或包涵体。

（3）病毒鉴定：最常用的方法是红细胞吸附抑制试验，亦可用血凝抑制试验，中和试验和补体结合试