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WB实验步骤详解

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创作时间：二零二一年六月三十日

创作时间：二零二一年六月三十日 之南宫帮珍创作

创作时间：二零二一年六月三十日

Western实验步伐 Western, 也称Western blot、Western blotting、Western印迹, 是用抗体检测卵白的重要方法之一.Western可以参考如下步伐进行把持. 1. 收集卵白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液,

例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等, 裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品.对某些特定的亚细胞组份卵白, 例如细胞核卵白、细胞浆卵白、线粒体卵白等, 可以参考相关文献提取这些亚细胞组份卵白, 也可以使用试剂盒进行抽提, 例如碧云天生产的细胞核卵白与细胞浆卵白抽提试剂盒(P0028). 收集完卵白样品后, 为确保每个卵白样品的上样量一致, 需要测定每个卵白样品的卵白浓度.根据所使用的裂解液的分歧, 需要采纳适当的卵白浓度测定方法.因为分歧的卵白浓度测定方法对一些去垢剂和还原剂等的兼容性分歧很年夜.如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液, 可以使用BCA卵白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012). 2.

电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制, 也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A).该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方. (2)

样品处置 在收集的卵白样品中加入适量浓缩的SDS-创作时间：二零二一年六月三十日

创作时间：二零二一年六月三十日 PAGE卵白上样缓冲液.例如2X或5X的SDS-PAGE卵白上样缓冲液.使用5X的SDS-PAGE卵白上样缓冲液可以减小上样体积, 在相同体积的上样孔内可以上样更多的卵白样品.5X的SDS-PAGE卵白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制, 也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE卵白上样缓冲液(5X)(P0015). 100℃或沸水浴加热3-5分钟, 以充沛变性卵白. (3) 上样与电泳 冷却到室温后, 把卵白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可. 为了便于观察电泳效果和转膜效果, 以及判断卵白分子量年夜小, 最好使用预染卵白质分子量标准(P0066). 电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A/P0014B). 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳, 而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳.对Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置, 低电压可以设置在80-100V, 高电压可以设置在120V左右.SDS-PAGE可以采纳普通的电泳仪就可以满足要求, 也可以采纳碧云天的多功能电泳仪(带按时)(EEP102).为了电泳方便起见, 也可以采纳整个SDS-PAGE过程恒压的方式, 通常把电压设置在100V, 然后设定按时时间为90－120分钟.设置按时可以防止经常发生的电泳过头. 通常电泳时溴酚蓝达到胶的底端处附近即可停止电泳,

或者可以根据预染卵白质分子量标准的电泳情况, 预计目的卵白已经被适当分离后即可停止电泳.3. 转膜(Transfer) 我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP30/FFP33).硝酸纤维素创作时间：二零二一年六月三十日

创作时间：二零二一年六月三十日 膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用, 但硝酸纤维素膜比力脆,

在把持过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开.膜的使用请参考生产商的推荐使用步伐. 通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置, 可以设定转膜电流为300-400mA, 转膜时间为30-60分钟.也可以在15-20mA转膜过夜.转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带按时)(EEP102).具体的转膜时间要根据目的卵白的年夜小而定, 目的卵白的分子量越年夜, 需要的转膜时间越长, 目的卵白的分子量越小, 需要的转膜时间越短. 在转膜过程中, 特别是高电流快速转膜时, 通常会有非常严重的发热现象, 最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜. 转膜的效果可以观察所使用的预染卵白质分子量标准, 通常分子量最年夜的1-2条带较难全部转到膜上.转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色, 以观察实际的转膜效果.也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色,

以观察卵白的残留情况. 4. 封闭(Blocking) 转膜完毕后,

立即把卵白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中,

漂洗1-2分钟, 以洗去膜上的转膜液.从转膜完毕后所有的步伐,

一定要注意膜的保湿, 防止膜的干燥, 否则极易发生较高的布景. 用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸尽洗涤液, 加入Western封闭液(P0023B), 在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟.对一些布景较高的抗体, 可以4℃封闭过夜.在整个Western过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)或类似创作时间：二零二一年六月三十日

创作时间：二零二一年六月三十日 仪器, 侧向摆动速度比力缓慢, 而且也容易让溶液覆盖卵白膜. 5.

一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书, 依照适当比例用Western一抗稀释液(P0023A)稀释一抗. 用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液, 立即加入稀释好的一抗, 室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时.如果一抗孵育一小时效果欠安, 可以4℃缓慢摇动孵育过夜.或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间. 回收一抗.加入Western洗涤液(P0023C), 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟.吸尽洗涤液后, 再加入洗涤液洗涤5-10分钟.共洗涤3次.如果结果布景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数. 注：Western结果通常需要提供内参作为对比, 通常可以选用Tubulin抗体(AT819)或Actin抗体(AA128), 进行内参检测. 6. 二抗孵育(Secondary antibody

inucubation) 参考二抗的说明书, 依照适当比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标识表记标帜的二抗. 二抗需根据一抗进行选择, 例如, 一抗是小鼠来源的IgG, 则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗, 如辣根过氧化物酶标识表记标帜山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216).碧云天有多种二抗提供. 用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液, 立即加入稀释好的二抗, 室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时. 回收二抗.加入Western洗涤液(P0023C), 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟.吸尽洗涤液后, 再加入洗涤液洗涤创作时间：二零二一年六月三十日

创作时间：二零二一年六月三十日 5-10分钟.共洗涤3次.如果结果布景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数.7. 卵白检测(Detection of

proteins) 参考相关说明书, 使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL类试剂来检测卵白.压片可以采纳专用的压片暗盒(FFC58/FFC83)进行. 洗片时可以使用X光片自动洗片机.如果没有自动洗片机, 可以用显影定影试剂盒(P0019/P0020)自行配制显影液和定影液进行手工洗片.X光片推荐选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMAT BT胶片(FF057/FF081). 8. 膜的重复利用(Membrane recovery) 如果卵白样品非常贵重, 可以使用Western一抗二抗去除液(P0025)处置卵白膜, 以重复利用卵白膜.

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wb实验凝胶电泳的原理

wb实验凝胶电泳的原理

wb实验凝胶电泳的原理

wb实验（Western blot）是一种分子生物学技术，可用于检测蛋白质的存在、定量、大小和性质。其原理基于凝胶电泳技术，通过将蛋白质样品经过蛋白质电泳分离后，将其转移到固定膜上进行检测。

具体实验步骤如下：

1. 准备蛋白质样品：通常将细胞或组织进行破碎，取其中的蛋白质作为样品。

2. 准备凝胶：将聚丙烯酰胺等材料制成凝胶，制成蛋白质电泳胶。

3. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，可以使用样品加载缓冲液来保持稳定。

4. 电泳：将凝胶放入电泳槽中，将电泳缓冲液注入电泳槽内，接通电源，施加电场，蛋白加载入凝胶中，经过分离。

5. 转移：将分离好的蛋白质移至电泳膜上。常用的转移方法有湿式转移和干式转移两种。

6. 探针反应：使用合适的探针来反应目标蛋白质，通常是特异性抗体。此时蛋白质与抗体发生反应，生成免疫复合物，可以使用色素等手段进行检测。

总的来说，wb实验的原理就是通过电泳分离蛋白样品，再用探针来检测、定位目标蛋白质。

wb实验步骤

wb实验步骤

一、培养的贴壁动物细胞的蛋白质抽提步骤

1、从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。

2、预冷的PBS清洗贴壁的细胞2次，小心倾去PBS。

3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液）。

4、细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂），轻轻摇动5分钟。

5、用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。

6、裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。

二、培养的悬浮动物细胞的蛋白质抽提步骤

1、2500xg离心10分钟沉淀悬浮的细胞，弃去上清液

2、预冷的PBS悬浮沉淀细胞，2500xg离心10分钟沉淀细胞，去上清。

3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液）。

4、加入含抑制剂的预冷蛋白质抽提试剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂）

5、轻轻摇动混和15分钟进行裂解。

6、裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。

三、哺乳动物组织的蛋白质抽提步骤

1、组织称重，切小块放入管中。

2、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5ul磷酸酶混合液）。

3、加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（250mg组织中加入1ml抽提试剂）。

4、用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解。 5、裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。

WB实验的基本原理及操作流程

WB实验的基本原理及操作流程

WB实验的基本原理及操作流程

WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。它通过将复杂的蛋白质混合物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。

一、基本原理

WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。具体步骤如下：

1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。

2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。

3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。

4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。

5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。

6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。

7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可检测信号物质（如酶或荧光染料）。 8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或荧光信号。

9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录目标蛋白质的表达。

二、操作流程

下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实验条件而有所变化。

1.样品制备：

a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。

b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。

c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。

2.SDS-电泳：

a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。

b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。

c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。

WB实验步骤详解

WB实验步骤详解

WB实验步骤详解

Western blotting（简称WB）是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质分离、转移和检测，可以用来确定特定蛋白质的存在和表达水平。本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者了解该技术的操作流程。

1. 细胞培养和蛋白提取。

首先，需要培养细胞并收集细胞样本。将细胞样本离心，去除培养基，然后用PBS洗涤细胞。接下来，加入细胞裂解液并振荡离心，收集上清液，即为蛋白提取物。

2. 蛋白质浓度测定。

使用BCA或Bradford方法测定蛋白提取物的浓度，以确保后续实验中使用的蛋白质量一致。

3. SDS-PAGE凝胶电泳。

将蛋白提取物加入蛋白负载缓冲液，然后加入SDS-PAGE凝胶槽中。进行电泳分离蛋白质，根据蛋白质大小和电荷不同，蛋白质会在凝胶中形成不同的条带。

4. 蛋白质转印。

将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到膜上，通常使用半湿式或全湿式转印。将蛋白质从凝胶转移到膜上，使得蛋白质可以与抗体结合。

5. 阻塞。

将膜放入含有蛋白质的溶液中，如5%脱脂奶粉或蛋白质阻塞缓冲液中，阻塞非特异性结合位点。

6. 一抗孵育。 加入第一抗体，孵育过夜。第一抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。

7. 洗涤。

用TBST或PBS洗膜，去除未结合的抗体。

8. 二抗孵育。

加入HRP标记的二抗，孵育1小时。二抗与第一抗体结合，形成复合物。

9. 洗涤。

用TBST或PBS洗膜，去除未结合的二抗。

10. 显色。

加入ECL显色液，使得膜上的蛋白质产生发光反应。将膜放入暗室中，用X光片曝光，然后用显影液显影。

11. 图像获取和分析。

将X光片放入X光片扫描仪中，获取蛋白质条带的图像。使用图像分析软件，如ImageJ，分析蛋白质的相对表达水平。

以上就是WB实验的详细步骤，每一步都至关重要，需要严格按照操作规程进行。希望本文能够帮助读者更好地理解WB实验的操作流程，并在实验中取得准确、可靠的结果。