第十章核酸分子杂交技术分析
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核酸分子杂交课件
探针标记
将标记物（如放射性同位素、荧 光染料等）连接到探针上，以便 于后续的信号检测。
杂交反应
预杂交
将样品和探针在一定温度和盐浓度下 进行预杂交，使探针与非目的序列的 核酸分子结合，排除非特异性结合。
杂交
将预杂交后的样品和探针进行杂交， 使探针与目的序列的核酸分子结合。
信号检测
放射自显影
对于放射性标记的探针， 可以通过放射自显影技术 检测杂交信号。
背景干扰
由于非特异性结合或交叉杂交的存在，可 能会导致背景干扰，影响结果的判断。
A 对探针质量要求高
探针的长度、纯度、标记方式等因 素都会影响杂交的效率和特异性， 因此需要高质量的探针才能获得可
靠的结果。
B
C
D
实验条件要求高
核酸分子杂交实验需要严格的实验条件， 如温度、盐浓度等，操作不当会影响实验 结果。
02
核酸分子杂交的基本步 骤
样品制备
01
02
03
细胞或组织破碎
通过物理或化学方法破碎 细胞或组织，释放出核酸 分子。
核酸提取
利用离心、沉淀、洗涤等 手段去除细胞碎片和蛋白 质等杂质，提取出核酸。
核酸变性
通过加热或化学试剂使核 酸双螺旋结构解开，形成 单链。
探针制备
目的基因克隆
将目的基因从生物体中克隆到载 体中，形成重组DNA分子。
生物信息学
利用生物信息学技术对核酸分子杂交 数据进行深入分析，挖掘更多有价值 的信息。
自动化与高通量技术
自动化技术
通过自动化技术实现核酸分子杂 交的快速、准确和高效检测，提
高检测效率。
高通量技术
利用高通量技术实现大规模样本 的同时检测，提高检测通量。
将标记物（如放射性同位素、荧 光染料等）连接到探针上，以便 于后续的信号检测。
杂交反应
预杂交
将样品和探针在一定温度和盐浓度下 进行预杂交，使探针与非目的序列的 核酸分子结合，排除非特异性结合。
杂交
将预杂交后的样品和探针进行杂交， 使探针与目的序列的核酸分子结合。
信号检测
放射自显影
对于放射性标记的探针， 可以通过放射自显影技术 检测杂交信号。
背景干扰
由于非特异性结合或交叉杂交的存在，可 能会导致背景干扰，影响结果的判断。
A 对探针质量要求高
探针的长度、纯度、标记方式等因 素都会影响杂交的效率和特异性， 因此需要高质量的探针才能获得可
靠的结果。
B
C
D
实验条件要求高
核酸分子杂交实验需要严格的实验条件， 如温度、盐浓度等，操作不当会影响实验 结果。
02
核酸分子杂交的基本步 骤
样品制备
01
02
03
细胞或组织破碎
通过物理或化学方法破碎 细胞或组织，释放出核酸 分子。
核酸提取
利用离心、沉淀、洗涤等 手段去除细胞碎片和蛋白 质等杂质，提取出核酸。
核酸变性
通过加热或化学试剂使核 酸双螺旋结构解开，形成 单链。
探针制备
目的基因克隆
将目的基因从生物体中克隆到载 体中，形成重组DNA分子。
生物信息学
利用生物信息学技术对核酸分子杂交 数据进行深入分析，挖掘更多有价值 的信息。
自动化与高通量技术
自动化技术
通过自动化技术实现核酸分子杂 交的快速、准确和高效检测，提
高检测效率。
高通量技术
利用高通量技术实现大规模样本 的同时检测，提高检测通量。
核酸分子杂交及PCR技术
核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。
2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。
常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的基本原理1、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。
可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。
以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。
DNA热变性现象双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。
同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。
由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。
增色效应和减色效应当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。
变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。
第十章 核酸分子的杂交技术
RNA提取
1.样品细胞的有效破碎； 2.使核蛋白复合体变性； 3.对内源RNA酶的有效抑制； 4.有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分
离；
• Northern blotting
三、斑点印迹杂交(dot bloting)
• 将RNA或DNA变性后直接点样于NC 膜或尼龙膜上
• 优点：简单、快速、可同时检测多 个样品
• 应用：确定DNA样品之间的同源性
四、核酸原位杂交(in situ hybridization)
1.定义：将标记的探针与细胞或组织切片 中的核酸进行杂交检测的方法。
2.特点： – 能在成分复杂的组织中进行单一细胞 的研究 – 不需从组织或细胞中提取核酸 – 能准确反映组织细胞的相互关系及功 能状态
2.多色荧光染色体原位杂交(multicolor FISH; mFISH )
3.比较基因组原位杂交(Comparative Genomic
Hybridization；CGH )
3.比较基因组原位杂交(Comparative Genomic
Hybridization；CGH )
利用两种不同的荧光分別标记两种不同細胞的 Genomic DNA ，再同时与正常的染色体进行 hybridization，染色体上不同荧光间的强弱 比值，由此比较而观察基因组中特定基因的 拷贝数变化。
毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测
• 步骤
1.待测DNA样品的制备、酶切
• DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释 放，用TE液溶解，交替使用酚、氯仿两 种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质
• 标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。
核酸分子杂交2011-09
– 缺口翻译法或切口平移法 – 随机引物法 – 末端标记法
• cDNA探针的标记，RNA探针的标记 探针的标记， 探针的标记 探针的标记
Ⅰ缺口翻译法或切口平移 （nick translation） ）
限量DNase I在待标记的 在待标记的dsDNA的每一条链上产生若干个 限量 在待标记的 的每一条链上产生若干个 单链缺口； 单链缺口； 利用E.coli DNA多聚酶 的5’-3’外切酶活性，在缺口处5’末 利用 多聚酶I的 外切酶活性，在缺口处 末 多聚酶 外切酶活性 端每切除一个核苷酸，则再利用5‘-3’多聚酶活性在 末端 多聚酶活性在3’末端 端每切除一个核苷酸，则再利用 多聚酶活性在 添加一个核苷酸，以修补缺口； 添加一个核苷酸，以修补缺口； 随着缺口在5’末端的移动 修饰的核苷酸就掺入到新合成的 随着缺口在 末端的移动,修饰的核苷酸就掺入到新合成的 末端的移动 DNA链中，即探针由5’末端向 端延伸。 链中，即探针由 末端向 端延伸。 末端向3’端延伸 链中
核酸分子杂交
（Nucleic Acid Hybridization ）
获得、检测和筛选目的基因的主要方法之一
Content
前言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术 5 DNA芯片技术 芯片技术
前
言
核酸分子杂交
有互补特定核苷酸序列的变性DNA或RNA单链，经 或 单链， 有互补特定核苷酸序列的变性 单链 退火处理，按照碱基互补原则形成 退火处理，按照碱基互补原则形成DNA-DNA或DNA或 RNA双链的过程叫分子杂交。 双链的过程叫分子杂交。 双链的过程叫分子杂交
priming )
• 随机寡核苷酸引物（random primer)：含有各种可能排列顺 随机寡核苷酸引物（ 序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交， 起到聚合酶反应引物的作用。一般6bp或6-8bp，可人工合成 或DNA酶I降解小牛胸腺DNA获得。 • E.coli DNA聚合酶I的Klenow大片段：仅具有5 性，而无5 3外切酶活性。 3聚合酶活
• cDNA探针的标记，RNA探针的标记 探针的标记， 探针的标记 探针的标记
Ⅰ缺口翻译法或切口平移 （nick translation） ）
限量DNase I在待标记的 在待标记的dsDNA的每一条链上产生若干个 限量 在待标记的 的每一条链上产生若干个 单链缺口； 单链缺口； 利用E.coli DNA多聚酶 的5’-3’外切酶活性，在缺口处5’末 利用 多聚酶I的 外切酶活性，在缺口处 末 多聚酶 外切酶活性 端每切除一个核苷酸，则再利用5‘-3’多聚酶活性在 末端 多聚酶活性在3’末端 端每切除一个核苷酸，则再利用 多聚酶活性在 添加一个核苷酸，以修补缺口； 添加一个核苷酸，以修补缺口； 随着缺口在5’末端的移动 修饰的核苷酸就掺入到新合成的 随着缺口在 末端的移动,修饰的核苷酸就掺入到新合成的 末端的移动 DNA链中，即探针由5’末端向 端延伸。 链中，即探针由 末端向 端延伸。 末端向3’端延伸 链中
核酸分子杂交
（Nucleic Acid Hybridization ）
获得、检测和筛选目的基因的主要方法之一
Content
前言 1 核酸分子杂交技术的原理 2 核酸探针的制备 3 核酸探针的标记 4 核酸分子杂交技术 5 DNA芯片技术 芯片技术
前
言
核酸分子杂交
有互补特定核苷酸序列的变性DNA或RNA单链，经 或 单链， 有互补特定核苷酸序列的变性 单链 退火处理，按照碱基互补原则形成 退火处理，按照碱基互补原则形成DNA-DNA或DNA或 RNA双链的过程叫分子杂交。 双链的过程叫分子杂交。 双链的过程叫分子杂交
priming )
• 随机寡核苷酸引物（random primer)：含有各种可能排列顺 随机寡核苷酸引物（ 序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交， 起到聚合酶反应引物的作用。一般6bp或6-8bp，可人工合成 或DNA酶I降解小牛胸腺DNA获得。 • E.coli DNA聚合酶I的Klenow大片段：仅具有5 性，而无5 3外切酶活性。 3聚合酶活
核酸分子杂交
第二节
核酸探针
probe：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段，用于
检测待测样品中的靶核酸序列。
核酸探针的类型 核酸探针的标记方法
核酸探针的检测
核酸探针的类型
按化学本质分：DNA探针
RNA探针
按标记物分：放射性标记探针 非放射性标记探针 按分子大小分：寡核苷酸探针 双链探针 单链探针
寡核苷酸探针：常为18-30bp
一、变性（denaturation）
1．概念： 在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键 断裂，疏水作用被破坏，有规则的结构被破坏，双股螺旋 （NDA）或发夹结构（RNA）打开，形成单链分子。 2．变性的因素： 加热、酸、碱、某些理化试剂（如尿素、甲酰胺）
增色效应（ hyperchronic effect ）：核酸变性时，紫外吸收值
DNA的熔解曲线 Tm值（melting temperature）:热变性时，50%DNA分子变性的温
度。又叫解链温度、熔解温度。
热变性
• • • • • 当温度＜70℃，DNA几乎不变性； 当温度介于70～90℃时，DNA部分变性； 当温度＞90℃，DNA完全变性； 当温度＞100℃，DNA双链分离； 通常核酸的变性温度可选在90～100℃之间。
TMB（四甲基联苯胺）→蓝色
第三节
核酸分子杂交技术
膜上印迹杂交 核酸原位杂交
一、膜上印迹杂交
指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与 存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。
印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定的固
相支持物上的方法。
1．固相支持物的选择
特点：较强的结合核酸的能力;
酰胺，则其Tm值为：
《核酸的分子杂交》PPT课件
亲缘关系； 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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2
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3
Content of Table
一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
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21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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3
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一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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核酸分子杂交技术
第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
DNA变性 中和 Southern印迹 预杂交 杂交 洗膜 检测
39
第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
毛细管转移示意图
40
第二节 核酸分子杂交的类型
二、Southern印迹杂交
电转移示意图
41
第二节 核酸分子杂交的类型
第二节 核酸分子杂交的类型
一、反向点杂交
二、Southern印迹杂交
三、Northern印迹杂交 四、原位杂交 其它命名如：斑点杂交
菌落杂交 微板酶联杂交
31
第二节 核酸分子杂交的类型
杂交分类
按照杂交的反应条件分为固相和液相杂交两类：
固相杂交 ➢ 探针 ➢ 被测DNA（RNA） ➢ 在固体支持物上杂交 ➢ 容易洗膜
碱性磷酸酶
罗丹明和FITC
地高辛
NT、PCR、RP 600W可见光照 365紫外线照 化学合成法或直接法
化学合成法或直接法
合成法
RP、NT
酶标亲和素或酶标 抗生物素抗体显色 抗生物素抗体显色 直接底物显色或用酶 抗体+底物显色 直接底物显色或用酶
抗体+底物显色 荧光显微镜观察或酶 标抗体+底物显色 酶标抗体+底物3显0 色
Northern印迹 杂交流程图
43
第二节 核酸分子杂交的类型
三、Northern印迹杂交
与Southern印迹杂交比较：
– RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染 – 所用的器材最好与Southern印迹实验的分开使用 – RNA变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解
RNA 2’-OH – 变性剂的作用：防止RNA分子形成发夹式的二级
核酸杂交技术分子生物学
❖用途：用于检测DNA和mRNA，以及研究基因表 达中的转录。
(3)寡核苷酸探针
采用化学合成的短链寡核苷酸探针, 最常用 的寡核苷酸探针有18-40个碱基。
特点：①链短、序列复杂度低、分子量小，与 等量靶位点完全杂交的时间短。 ②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱 基的变化。 ③一次可大量合成寡核苷酸探针，使得 这种探针价格低廉。
➢将电泳凝胶移至碱性溶液中浸泡，使DNA变性，再用中性 pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。
4、将DNA转移至尼龙膜
将凝胶中单链DNA片段转移到固相支持物上。注意保持各 DNA片段的相对位置不变 。
用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC 膜）、尼龙（Nylon）膜、PVDF膜、化学活化膜和滤纸等 。
（四）从冰箱中取出暗盒，置室温12h，使其温度上升至室温，然后冲 洗X光底片。
➢ Southern blot 的应用
Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术， 在遗传诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方 面有重要价值。
DNA指纹分析
血迹中的DNA
（二）、Northern印迹（northern blot ）
核酸探针的质量（标 记效率和特异性）是核 酸分子杂交成功的关键。
1. 核酸探针的分类
➢根据标记物的性质分：
❖ 放射性标记:32P,35S,125I, 3H。
敏感度高，半衰期短（32P 14.3天，35S 87.1天， 125I 60天，3H 的半衰期长达12.3年，但它所释放 β放射线能量太低，只能用于组织原位杂交）， 有辐射危害。
大肠杆菌DNA聚合 酶Ⅰ：5’→3’DNA 聚 合酶活性； 5’→3’ 核酸外切酶活性
（2）随机引物法（random priming）
(3)寡核苷酸探针
采用化学合成的短链寡核苷酸探针, 最常用 的寡核苷酸探针有18-40个碱基。
特点：①链短、序列复杂度低、分子量小，与 等量靶位点完全杂交的时间短。 ②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱 基的变化。 ③一次可大量合成寡核苷酸探针，使得 这种探针价格低廉。
➢将电泳凝胶移至碱性溶液中浸泡，使DNA变性，再用中性 pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。
4、将DNA转移至尼龙膜
将凝胶中单链DNA片段转移到固相支持物上。注意保持各 DNA片段的相对位置不变 。
用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC 膜）、尼龙（Nylon）膜、PVDF膜、化学活化膜和滤纸等 。
（四）从冰箱中取出暗盒，置室温12h，使其温度上升至室温，然后冲 洗X光底片。
➢ Southern blot 的应用
Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术， 在遗传诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方 面有重要价值。
DNA指纹分析
血迹中的DNA
（二）、Northern印迹（northern blot ）
核酸探针的质量（标 记效率和特异性）是核 酸分子杂交成功的关键。
1. 核酸探针的分类
➢根据标记物的性质分：
❖ 放射性标记:32P,35S,125I, 3H。
敏感度高，半衰期短（32P 14.3天，35S 87.1天， 125I 60天，3H 的半衰期长达12.3年，但它所释放 β放射线能量太低，只能用于组织原位杂交）， 有辐射危害。
大肠杆菌DNA聚合 酶Ⅰ：5’→3’DNA 聚 合酶活性； 5’→3’ 核酸外切酶活性
（2）随机引物法（random priming）
核酸分子杂交技术李ppt文档
4. 随机引物延伸标记方法
是从单链DNA或RNA模板合成高比活 性的32P标记探针所选用的方法。原理: 使 长 6-8nt 的 寡 核 苷 酸 片 段 与 变 性 的 DNA 或 RNA模板退火，在DNA聚合酶I的作用下， 以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为 引物引发DNA链的合成，在反应时将α-32P dNTP掺入合成链，即得到标记。变性处 理后，新合成链（探针片段）与模板解离， 即得到无数各种大小的探针DNA。因为所 用真核苷酸片段很短，在低温条件下可与 模板DNA随机发生退火反应，因此，被称 为随机引物(random primer)。这种随机引 物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备。
2. DNA快速核酸标记
大肠杆菌聚合酶I经枯草杆菌酶切割可得到两条多肽 链，其中分子量为76kD的大片断称为Klenow片段。该酶 具有完整聚合酶I的5’→3’ 核酸聚合酶活性和3’→5’ 核酸 外 切 酶 活 性 ， 但 缺 乏 5’→3’ 核 酸 外 切 酶 活 性 。 利 用 Klenow片段可以填补由限制性酶消解DNA所产生的3’凹 陷末端。因此，用这种方法可以标记双链DNA的凹陷3’ 末 端 。 用 Klenow 片 段 标 记 末 端 一 般 只 用 一 种 [α-32P] dNTP，加入反应的[α-32P] dNTP取决于延伸的5’末端序 列。
核苷酸经某一原子、功能基团或长侧链修饰后仍有可 能进行碱基配对，这取决于修饰的部位和修饰物的性质。
标记的探针每1kb只掺入10-30个修饰碱基，仅4％-12 ％的单个碱基被修饰的类似物取代。
尽管掺入位点处的碱基配对较弱或不存在，但对整个 杂交分子的稳定性影响很小。
二、核酸探针的种类
根据标记方法不同可分为：
放射性探针
非放射性探针
《核酸分子杂交》课件
实验步骤
1
样品制备
获得需要研究的核酸样品并进行提取和
合成探针和标记物
2
纯化。
设计和合成与目标核酸互补的DNA或
RNA探针，并标记探针以便检测。
3
杂交反应
将待测核酸样品与探针和标记物进行杂
杂交产物的检测和分析
4
交反应，使它们结合形成杂交分子。
通过不同的检测方法对杂交产物进行分 析和表征，如凝胶电泳、放射性测量等。
核酸杂交的种类
DNA-DNA杂交
两段DNA互相结合形成双链 DNA。
RNA-DNA杂交
RNA和DNA互相结合形成 RNA-DNA杂交分子。
RNA-RNA杂交
两段RNA分子互相结合形成 双链RNA。
应用
检测病原微生物、基因 突变、肿瘤等
核酸分子杂交可用于诊断病 原微生物感染、检测基因突 变和肿瘤相关标记物。
《核酸分子杂交》PPT课 件
核酸分子杂交是指不同DNA或RNA进行结合形成杂交分子的过程。它在分析 核酸序列的同源性和差异性、检测特定序列的核酸以及研究DNA和RNA的结 构、功能和互动关系方面非常重要。
定义
核酸分子杂交是指来自不同DNA或RNA的单链或双链核酸互相结合形成杂交 分子的过程。
重要性
研究基因表达、基因调 控等
通过核酸分子杂交，我们可 以研究基因的表达模式和调 控机制。
设计新型药物和检测方 法
利用核酸分子杂交技术，可 以设计基于核酸的新型药物 和高灵DNA和RNA的结
性和差异性
核酸
构、功能和互动关系
核酸分子杂交可用于比较 DNA或RNA序列，帮助我 们了解核酸之间的相似性 和差异性。
通过配对互补的探针和标 记物，核酸分子杂交可用 于检测具有特定序列的核 酸分子。
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第十章核酸分子杂交技术分析
（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的
单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液
第十章核酸分子杂交技术分析
（四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固
相支持物上的过程
第十章核酸分子杂交技术分析
1、固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性
第十章核酸分子杂交技术分析
2、Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中 的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是： 容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬 酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤 纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动， 同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝 胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上
一、DNA变性与复性
（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
第十章核酸分子杂交技术分析
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
第十章核酸分子杂交技术分析： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂 交效率
第十章核酸分子杂交技术分析
2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃ （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃
双链核酸分子链间的氢键断裂。
第十章核酸分子杂交技术分析
3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加
第十章核酸分子杂交技术分析
4、DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线
第十章核酸分子杂交技术分析
5、GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3
①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 非特异吸附少
第十章核酸分子杂交技术分析
（2）常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
第十章核酸分子杂交技术分析
（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相 支持物上。
第十章核酸分子杂交技术分析
（3）真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤 膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空 室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器 中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带 动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤 维素膜上。
杂交率取决于DNA的相对复杂性
第十章核酸分子杂交技术分析
6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针
的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶 液或脱脂奶粉
第十章核酸分子杂交技术分析
第二节 核酸分子杂交的方法 按待测核酸是否固定在固相支持物上分：
第十章核酸分子杂交技术分析
（二）复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下
按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复 性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸 /DNA和寡核苷酸/RNA。
第十章核酸分子杂交技术分析
2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 （4）形成完整的双链分子
核酸分子杂交技术
第一节 核酸分子杂交的基本原理
• 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知
核酸序列称探针。 • 杂交有固一液相杂交和液相杂交。
第十章核酸分子杂交技术分析
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
第十章核酸分子杂交技术分析
第十章核酸分子杂交技术分析
3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂
交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进
行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
第十章核酸分子杂交技术分析
4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交
• 固-液相杂交 膜上印迹杂交 原位杂交
• 液相杂交 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析第法十章核酸分子杂交技术分析
一、Southern印迹杂交 （一）待测核酸样品的制备
1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
第十章核酸分子杂交技术分析
（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记
液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶 液在68℃杂交
第十章核酸分子杂交技术分析
5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序
的总长度 （2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对
（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的
单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液
第十章核酸分子杂交技术分析
（四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固
相支持物上的过程
第十章核酸分子杂交技术分析
1、固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性
第十章核酸分子杂交技术分析
2、Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中 的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是： 容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬 酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤 纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动， 同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝 胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上
一、DNA变性与复性
（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
第十章核酸分子杂交技术分析
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
第十章核酸分子杂交技术分析： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂 交效率
第十章核酸分子杂交技术分析
2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃ （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃
双链核酸分子链间的氢键断裂。
第十章核酸分子杂交技术分析
3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加
第十章核酸分子杂交技术分析
4、DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线
第十章核酸分子杂交技术分析
5、GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3
①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 非特异吸附少
第十章核酸分子杂交技术分析
（2）常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
第十章核酸分子杂交技术分析
（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相 支持物上。
第十章核酸分子杂交技术分析
（3）真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤 膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空 室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器 中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带 动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤 维素膜上。
杂交率取决于DNA的相对复杂性
第十章核酸分子杂交技术分析
6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针
的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶 液或脱脂奶粉
第十章核酸分子杂交技术分析
第二节 核酸分子杂交的方法 按待测核酸是否固定在固相支持物上分：
第十章核酸分子杂交技术分析
（二）复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下
按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复 性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸 /DNA和寡核苷酸/RNA。
第十章核酸分子杂交技术分析
2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 （4）形成完整的双链分子
核酸分子杂交技术
第一节 核酸分子杂交的基本原理
• 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知
核酸序列称探针。 • 杂交有固一液相杂交和液相杂交。
第十章核酸分子杂交技术分析
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
第十章核酸分子杂交技术分析
第十章核酸分子杂交技术分析
3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂
交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进
行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
第十章核酸分子杂交技术分析
4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交
• 固-液相杂交 膜上印迹杂交 原位杂交
• 液相杂交 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析第法十章核酸分子杂交技术分析
一、Southern印迹杂交 （一）待测核酸样品的制备
1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
第十章核酸分子杂交技术分析
（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记
液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶 液在68℃杂交
第十章核酸分子杂交技术分析
5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序
的总长度 （2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对