实验报告2荧光分光光度法测定维生素B2的含量

荧光分光光度法测维生素B2的含量一、实验目的1.了解荧光分析法的原理2.学习荧光公光光度计的使用方法二、实验原理维生素B2在230—490nm范围波长的照射下，激发出峰值在526nm左右的绿色荧光，在pH=6-7的溶液里荧光最强，在pH=11时荧光消失。

三、仪器与试剂荧光分光光度计、容量瓶、玻璃棒10.0ug/ml维生素B2标准液：称取10.0mg维生素B2，先溶解于少量的1%乙酸中，然后用1%乙酸定容至1000ml。

溶液应该保存在棕色瓶中，置于阴凉处。

四、实验步骤1. 标准系列溶液的配制取6个25ml比色管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0ml及2.5ml维生素B2标准溶液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。

2．测定荧光激发光谱和发射光谱取上述第3号标准系列溶液，测定激发光谱和发射光谱。

先固定发射波长为525nm，在400—500nm区间进行激发波长扫描，获得溶液的激发光谱和荧光最大激发波长λex再固定激发波长为λex，在480—600nm区间进行发射波长扫描，获得溶液的发射光谱和荧光最大发射波长λem。

3.标准曲线的绘制（1）波长的设定：将激发波长和发射波长分别设定为上述得到的λex T和λem 值。

（2）绘制标准曲线：用1号标准系列溶液将荧光强度“调零”，然后分别测定2—6号标准系列溶液的荧光强度。

4.未知试样测定取未知试样溶液2ml置于25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，测定此溶液的荧光强度。

五、实验数据及结果（1）从绘制的维生素B2的激发光谱和发射光谱曲线上，确定其最大激发波长和最大发射波长；（2）从绘制维生素B2的标准曲线，并从标准曲线上确定未知试样溶液中维生素B2的浓度；（3）计算出原始未知试样中维生素B2的浓度。

六、注意事项测定的顺序要从稀到浓，以减小测量误差。

七、思考题（1）什么是荧光激发光谱？如何绘制荧光激发光谱？（2）什么是荧光发射光谱？如何绘制荧光发射光谱？。

分子荧光光度法测定维B药片中维生素B2的含量1实验目的1.1了解荧光光度法的基本原理；1.2 掌握荧光光度仪的使用方法并熟悉其构造；2实验原理维生素B2又称核黄素，溶于水，在偏酸性缓冲溶液中是一种强荧光物质，在碱性溶液中较易被破坏。

维B2在缓冲溶液中具有很强的荧光效应，其激发波长和发射波长分别为445nm和525nm。

根据维B2的荧光强度与其浓度成正比，可以测定药品中维B2的含量。

3 仪器与试剂LS-55型荧光光度仪4实验步骤4.1标准溶液的配置：标准系列溶液用的是前一组同学刚做好的一组标准4.2缓冲溶液的配置：量取12.5ml冰醋酸放入500ml容量瓶中，称取24.4g 醋酸钠溶解，转移到装有冰醋酸的500ml的容量瓶中，用蒸馏水定容，得到500mlpH约为4.6的缓冲溶液，待用4.3样品处理：去10片左右复合维生素B片，用研钵研成粉末，准确称取粉末约两份，分别放入两个干净的并编号的小烧杯中，用已经配好的缓冲溶液进行溶解，再分别转移到50ml的容量瓶中，做好标记，用缓冲溶液进行定容。

同时做好样品空白，标记好。

样品溶液的稀释：将两个样品和一个样品空白进行稀释，将每个都稀释500倍，待用。

4.4标准曲线的绘制：分别用标准溶液润洗比色皿，再将标准系列溶液分别进行测定，得出标准工作曲线，记录数据，并处理。

4.5样品的测定：分别用稀释后的样品溶液润洗比色皿，再分别进行测定，进行数据记录，并处理。

4.6数据记录：激发波长为445nm ，发射波长为525nm标准系列核黄素浓度/(μgml-1)0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 信号值1.138 70.401 137.754 198.289 268.744 360.905样品测定数据记录样品1 质量为0.400g 样品2 质量为 0.230g由此计算出样品1中维B2含量6.06mg 百分含量=1.52%样品2中维B2含量2.67mg 百分含量=1.16%计算示例样品1 含量={ [170+（3.358+2.595+2.483）/3-5.213]+2.442}/701.2·500·50ug =6.06mg总结分析本次试验同样药品测出的结果，可以发现样品1 、2的含量并不相同。

维生素B2含量的测定一、实验目的：学习分子荧光产生的原理；利用荧光分光光度计绘制荧光激发与发射光谱图；学会判断谱图中各种峰的类型的方法。

二、实验原理：分子吸收短波长（高能量）的光后，能量释放以光的形式出现，而发射较激发光波长更长的荧光。

三、实验内容：1.维生素B2荧光激发光谱与发射光谱的绘制；打开软件并打开Edit窗口，根据实验目的设置测定参数。

例如：绘制发射光谱，设定激发波长为377nm（或者454nm），发射波长范围400～700nm。

绘制激发光谱可设定发射波长为527nm，激发波长范围为200～500nm。

根据图形，确定激发光谱和发射光谱荧光峰的位置。

2.维生素B2系列标准溶液的配制；分别取0.1000g/L标准溶液0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0ml定量转移至25ml 容量瓶中，用去离子水稀释至25ml。

3.在选定激发波长（λ1）下测量系列标准溶液的荧光发射光谱，测定在选定波长（λ2）下的荧光强度并绘制标准工作曲线；4.维生素B2片的处理：取维生素B2片（约0.065g）一片，用玻璃棒捣碎后定量转移至250ml容量瓶中，然后取5.00ml溶液稀释至25.00ml，在选定激发波长（λ1）下测量待测溶液的荧光发射光谱，测定在选定波长下（λ2）的荧光强度并计算维生素B2的浓度（g/L）；5.根据以上数据，求出维生素B2的含量（以百分比浓度表示x％）。

四、注意事项：1.绘制标准工作曲线与待测溶液所选定的波长λ1/λ2应一致；2.能正确识别荧光光谱中的干扰峰（拉曼光等）五、思考题1. 为何荧光分析的灵敏度通常比紫外可见吸收光谱的灵敏度高2～4个数量级？2. 具有哪些结构的分子通常具有较高的荧光量子产率？。

实验八、荧光光度法测定维生素B2的含量内容：P94-97和P208-210一、实验目的1、学习荧光分光光度计的工作原理2、熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法3、掌握荧光光度分析法测定维生素B2的方法二、实验原理在紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的荧光。

以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。

对同一物质，若alc << 0.05，即对很稀的溶液，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系：F = 2.3 Φf I0alc，I0和l不变时，F = K⋅c (K为常数)。

因此，在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。

维生素B2在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为535 nm。

维生素B2的荧光在pH值为6～7时最强，在pH值为11时消失。

荧光分析实验首先选择滤光片，使测量获得最强荧光，且受背景影响最小。

激发光谱受选择激发滤光片的依据，该滤光片的最大透射比与待测物质激发光谱的最大峰值波长相近。

荧光光谱是选择荧光滤光片的主要依据。

本实验使用的Cary Eclipse荧光分光光度计，其预扫描功能可自动识别出该容积的拉曼、瑞利及二级散射峰，并在扫描结束后自动给出最佳的激发/发射波长。

本实验采用标准曲线法来测定维生素B2的含量。

三、实验仪器与试剂（略）四、实验内容1、扫描测定取待测液2.50 mL置于50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用Cary Eclipse 荧光分光光度计进行扫描测定，选择最佳的激发/发射波长。

2、浓度测定在5个50 mL容量瓶中，分别加入1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL 维生素B2的标准溶液，稀释，定容。

选定扫描测定确定的最佳激发/发射波长，用Cary Eclipse荧光分光光度计依次从稀到浓测量系列标准溶液和待测液稀释液的荧光强度。

五、结果与分析1、标准系列溶液的荧光强度绘制标准曲线。

荧光光度分析法测定维生素B2的含量引言荧光分光光度法简介有些物质，当用紫外光反射时，它稀释某种波长之后还可以升空出来各种颜色和强度相同的光；而当紫外光暂停反射后，这种光线也随之消失，这种光线称作荧光。

荧光的波长比稀释的紫外光波长略长。

由于物质分子结构不同，所吸收的紫外光波长和发射的荧光波长也有所不同。

利用物质的这个特性，可以对物质进行定性分析。

同一种分子结构的物质，用同一种波长的紫外光照射，可发射相同波长的荧光；若该物质的浓度不同，所发射的荧光强度也不同，利用这个性质可以对物质进行定量分析。

这种定量方法称为荧光分析法，简称荧光法。

测量荧光的仪器有滤光片荧光计，滤光片―单色器荧光计和荧光分光光度计。

荧光法的选择性好，灵敏度比紫外-可见分光光度法高2~3数量级，检出限低，可以达到10~12g／m1，线性范围宽。

现在主要应用的是荧光分光光度计。

【实验目的】1.自学荧光光度法测量维生素b2的含量的基本原理和方法。

2.熟识荧光光度计的结构及采用方法。

【实验原理】在经过紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的荧光。

在稀溶液中，荧光强度if与物质的浓度c有以下关系：if?2.303?i0?bc当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：if?kc这种以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。

荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度，可成倍提高荧光强度。

同时，提高仪器灵敏度，可提高荧光光度法的灵敏度。

而吸收光度法，无论是提高激发光强度还是提高仪器灵敏度，入射光和出射光同时增大，其灵敏度不变。

因此，荧光光度法比吸收光度法灵敏度高。

vb2(即为核黄素)在430～440nm蓝光反射下，收到绿色荧光，其峰值波长为535nm。

vb2的荧光强度在ph6～7时，在ph=11时基本消失。

维生素b2（又叫核黄素，vb2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：vb2易溶于水而不溶乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中平衡，光照极易水解，对热平衡。

实验五荧光光度法测定维生素B2的含量一、实验目的1、学习荧光分光光度法测定维生素B2的分析原理；2、掌握荧光分光光度计的操作技术与测定维生素Bgq方法。

二、实验原理1、荧光光度法原理(1)常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态,发出比吸收光波长长的光而产生荧光。

在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：I F = 2.3034I。

血当实验条件一定时,荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：I F = Kc这就是荧光光谱法定量分析的理论依据。

(2)荧光分析法的特点：a、与紫外-可见分光度法比较,荧光分析法具有更高的灵敏度。

b、选择性好。

荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。

c、所需试样量少、操作方法简便。

(3)荧光光谱激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。

激发光谱曲线的最高处,处于激发态的分子最多，荧光强度最大。

发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长)，化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。

固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。

激发光波长与发射荧光波长的选择就是本实验的关键。

(4)荧光分析仪器常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器与显示记录器五部分构成,如下图所示：2、荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量维生素BJ又叫核黄素,VB）就是橘黄色无臭的针状结晶,其结构式为:O维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂,在中性或酸性溶液中稳定,光照易分解，对热稳定。

维生素B2溶液在430〜440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光, 荧光峰在535 nm。

维生素B在pH=6〜7的溶液中荧光强度最大,在pH=11的碱性溶液中荧光消失,所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。

一、实验目的1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。

2、了解荧光分光光度计基本原理、结构及性能，掌握基本操作。

二、实验原理维生素B2(又叫核黄素，VB2)是橘黄色无臭的针状结晶。

其分子式为：C17H20N4O6，分子量：376.4。

VB2分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。

VB2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。

VB2溶液在430～440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。

VB2在pH＝6～7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与VB2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测VB2的含量。

VB2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比VB2的荧光强得多，故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

在稀溶液中，当实验条件一定时，荧光强度F与荧光物质浓度c 呈线性关系：F=Kc，这是荧光光谱法定量分析的依据。

注意：高浓度时，荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使F与c不呈线性关系。

三、主要仪器与试剂主要仪器：荧光分光光度计；1cm石英皿；25mL比色管；1mL、5mL移液管试剂：VB2标准溶液5.0μg/mL；待测样品溶液四、实验步骤1、系列标准溶液的制备取VB2标准溶液0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL 分别置于25mL比色管中，各加入去离子水稀释至刻度，摇匀。

得浓度依次为0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.30μg/mL、0.40μg/mL、0.50μg/mL 的一系列VB2标准溶液。

待测。

2、激发光谱和荧光发射光谱的绘制设置λem＝540nm为发射波长，在250～500nm范围内扫描，记录荧光发射强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。

从激发光谱图上可找出其最大激发波长λex。

从得到的激发光谱中找出最大激发波长，在此激发波长下，在450～700nm范围内扫描，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。

荧光分光光度法测定维生素B2的含量实验项目：荧光法定量测定维生素B2的含量实验目的：1.掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理含有荧光基团的化学物质维生素B2，在吸收光能而被激发以后发射荧光，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关。

溶液中维生素B2被入射光（I0）激发后，可以在溶液的各个方向观察荧光强度（I f）。

在低浓度时，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系。

标准曲线法是取一定已知量的维生素B2的对照品与待分析试样溶液经过相同的处理后，将对照品配制成一系列浓度的对照溶液，测定其荧光强度，并以荧光强度为纵坐标，以对照溶液浓度为横坐标绘制工作曲线，然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度，由工作曲线求出维生素B2片试样中荧光物质的含量。

2.了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，基本操作荧光分光光度计的基本原理：由氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接收，然后以图或数字的形式显示出来。

物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光.。

荧光分光光度计的主要部件：①光源：为高压汞蒸气灯或氙灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。

②激发单色器：置于光源和样品池之间的为激发单色器，筛选出特定的激发光谱。

③发射单色器：置于样品池和检测器之间的为发射单色器，常采用光栅为单色器，筛选出特定的发射光谱。

④样品池：通常由石英池组成。

⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器，可将光信号放大并转为电信号。

光源发射的激发光通过入射狭缝，经激发单色器分光后照射到被测物质上，发射的荧光再经发射单色器分光后用光电倍增管检测，并经信号放大系统放大后记录。