噬菌体的危害及预防措施

第七节噬菌体phage非细胞生物真病毒euvirus：至少含有核酸和蛋白质两种组分亚病毒subvirus类病毒viroid：只含具单独侵染性的RNA组分拟病毒virusoid：只含不具单独侵染性的RNA组分朊病毒prion：只含蛋白质一种组分真病毒的定义一类超显微的非细胞生物，每种病毒只含有一种核酸；它们只能在活细胞内营专性寄生，靠寄主代谢系统的协助来复制核酸、合成蛋白质等组分，然后进行装配而得以增殖；在离体条件下，它们能以无生命的化学大分子状态长期存在并保持其侵染活性。

病毒的分类依据宿主范围——植物病毒、动物病毒、微生物病毒噬菌体是感染细菌和放线菌的病毒。

病毒的化学组成与构造化学组成——核酸( DNA 或 RNA)、蛋白质构造基本构造——核衣壳：核酸、衣壳非基本构造——包膜、刺突第六节噬菌体 Bacteriophage, phage噬菌体是一类感染细菌或放线菌的病毒。

一、噬菌体的特点1、无细胞结构，仅含一种核酸；2、不能进行独立的代谢作用；3、严格的活细胞寄生；4、个体极小，能通过细菌滤器二、噬菌体的形态与构造1、形态噬菌体的基本形态有蝌蚪形、微球形和丝状三种。

噬菌体的类型2、构造E. coli T4构造：头部（正二十面体）；颈环；尾鞘、尾髓；基片、刺突、尾丝3、大小T4：头部 65 ×95nm，尾部20 ×95nm f2：f20~25nm4、化学组成：蛋白质；核酸：dsDNA, dsRNA, ssDNA, ssRNA三、噬菌体的生长和繁殖1、吸附 adsorption噬菌体的吸附器官与受体细胞的特殊位点的接触与结合吸附的专一性：寄主专一性；位点专一性：T3、T4、T7----脂多糖；T2、T6----脂蛋白；雄性专一噬菌体----性纤毛。

过程：尾丝散开，刺突固着于特异性位点T4吸附对于T类噬菌体的吸附器官是尾丝和刺突，尾丝首先触及寄主细胞表面，然后刺突固定。

2、侵入penetration ——噬菌体核酸物质进入受体细胞•T4：尾部的酶水解细菌细胞壁肽聚糖层产生一小孔,尾鞘收缩,尾髓伸入细胞中,头部的核酸被压进细菌细胞,蛋白质外壳留在细胞外。

发酵过程中噬菌体感染问题1 噬菌体噬菌体是侵染细菌的微生物病毒，广泛分布于自然界中。

在生产中见到的噬菌体为蝌蚪形，直径约0.1um，其形态在显微镜下看不见，通过电子显微镜放大9×104倍后才能看见。

故在生产中平时对噬菌体看不见摸不着，无形之中增加了对其了解和预防的难度。

2 噬菌体的主要特性2.1专一的寄生性。

噬菌体只能在专一的宿主细胞中生长繁殖，只能在活的、处于繁殖阶段的细胞中生长繁殖，不能脱离宿生而自行生长繁殖。

如果不同菌株的亲缘关系比较近，那么此菌株也是会感染的，特别是针对长期生产同一产品的发酵工厂要特别注意，在换新菌株之前必须了解其背景。

2.2不耐热性。

游离的噬菌体在45℃条件下10min就可使其失活。

2.3不耐药性。

直接在噬菌体上喷洒1%新洁尔灭、75%酒精、1%双氧水、5%的甲醛等都可使其失活。

3 感染噬菌体后的现象噬菌体分烈性噬菌体和温和性噬菌体。

温和性噬菌体由于其潜在的危害性大，有时候感染了，但不爆发，为以后的大面积爆发埋下了隐患。

在从事发酵工作时就遇到，车间周围环境恶化的已经相当厉害，仅一个星期中上的罐中有75%罐都爆发了噬菌体，除了一罐以外，且表观中基本看不出染噬菌体的现象，而电镜观察是能看到噬菌体存在的。

感染后爆发的现象有：3.1发酵液光密度开始上升，而后下降。

但有时也不上升，当把1%的噬菌体人为的接入罐中，光密度始终处于最低位3.2 pH逐渐上升，一般升到7.5，不再下降3.3耗糖、氨缓慢或停止3.4 OD回升3.5泡沫大、料液略黏3.6镜检时发现菌体减少，发胖，革兰氏染色后呈现红色碎片。

严重时，可出现拉丝或网状，或呈鱼刺状，几乎看不到完整菌体。

3.7用含有噬菌体的发酵液点在平板上能看到噬菌斑4 噬菌体的预防4.1五大误区4.1.1精度为0.01um的空气过滤器能阻拦噬菌体空气。

过滤器中的0.01um的精度不是单指膜的精度，他是把布朗运动、撞击等拦截都计算在内的，故0.01um只是个相对精度，实际上膜的绝对精度在0.2um左右，故0.01um的空气过滤器可以挡住一部分噬菌体，但不能完全挡住。

紫外线诱变选育α-淀粉高产菌株一、实验目的1.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。

2.通过诱变技术筛选出高产ɑ-淀粉酶的菌株。

二、实验原理紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。

紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。

被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。

同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。

本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌，通过透明圈法初筛，选择淀粉酶活力高的生产菌株。

三、实验材料1.菌种产淀粉酶枯草芽孢杆菌2.器材装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10m L离心管、（1、5、10m L）吸管、250m L三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球3.培养基和试剂①无菌水、75%酒精②0.5％碘液碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200m L，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。

③选择培养基可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，N a C l0.5g，琼脂2g，蒸馏水100m L，p H6.8～7.0，121℃灭菌20m i n。

④肉汤培养基牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，N a C l0.5g，蒸馏水100m L，p H7.2～7.4，121℃灭菌20m i n。

四、实验步骤1.菌体培养取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20m L肉汤培养基的250m L三角瓶中，于37℃振荡培养12h，即为对数期的菌种。

2.菌悬液的制备取5m L发酵液于10m L离心管中，以3000r/m i n离心10m i n，弃去上清液。

加入无菌水9m L，振荡洗涤，离心10m i n，弃去上清液。

噬菌体的应用与防治刘秀侠;穆熙军;孙学森;张继晓;迟文超;王兰伟;许燕侠;谷巍【摘要】噬菌体结构简单,有严格的宿主特异性,可用于治疗致病菌感染引起的疾病,对医学微生物学、遗传学、分子生物学等学科的发展起到推动作用.噬菌体作为生物界的一员,在自然界中分布极广,给人类生产发酵带来了极为不利的影响.综述了噬菌体的应用前景、潜在风险及防治措施.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(000)032【总页数】3页(P12604-12606)【关键词】噬菌体;应用;防治【作者】刘秀侠;穆熙军;孙学森;张继晓;迟文超;王兰伟;许燕侠;谷巍【作者单位】山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院,山东泰安271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院,山东泰安271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院,山东泰安271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院,山东泰安271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院,山东泰安271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院,山东泰安271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院,山东泰安271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院,山东泰安271000【正文语种】中文【中图分类】S852.65噬菌体是感染细菌和放线菌等微生物的病毒，最早由英国细菌学家 Twort［1］和加拿大细菌学家 Herelle［2］分别于 1915年和1917年发现，广泛存在于适合宿主菌生存的泥土、污水和空气等自然界中，对于维持生态系统中不同细菌种类间的动态平衡起到非常重要的作用。

噬菌体结构简单、基因数少，是分子生物学及基因工程的良好试验系统。

但是，噬菌体的负面作用不容忽视，微生物在工业发酵生产中极易被噬菌体污染，导致发酵异常，造成倒罐的严重损失。

笔者探讨了噬菌体在各领域的应用前景及防治措施。

1 噬菌体的应用1.1 作为分子生物学研究的试验工具噬菌体是遗传调控、复制、转录与翻译等方面的生物学基础研究和基因工程中的重要材料或工具［3］。

噬菌体的污染和防治在许多发酵生产中，如氨基酸发酵、丙酮-丁醇发酵和抗生素发酵中常常遇到噬菌体（b acteriaphage）污染，引起溶菌，并随之出现发酵迟缓或停止发酵等异常现象。

本节主要介绍噬菌体污染的特征，检查方法及防治措施。

一噬菌体污染的特征1 发酵液光密度上升缓慢，甚至下降，肉眼可见发酵液逐渐变清；2 耗糖速度缓慢或停止，产物生成量少或不增加，发酵液中残糖高；3产生大量泡末，发酵液呈粘稠状；4 菌体不规则，甚至出现畸形。

二噬菌体的检查方法1．双层琼脂平板法（1）双层琼脂平板的制备：先用7~8mL 2%的琼脂培养基作底层，凝固后，加入3~4mL 冷至45℃的1%琼脂上层培养基（其中含0.2mL发酵菌种悬液和0.1mL待检发酵液），让其平整凝固；（2）在发酵菌的适宜温度下培养，若是细菌，一般培养16~20小时。

（3）检查有无透明的噬菌斑。

2．液体培养检查法将培养基、发酵菌种及待检发酵液三者混合，培养后观察培养液是否变清。

3．斑点试验法先制备好涂布有发酵菌种的平板，再用接种环或无菌吸管取少许发酵液在平板上点种，培养后，观察是否有噬菌斑。

4．玻片快速法将发酵菌种、发酵液和少量琼脂培养基（含0.5~0.8%的琼脂）混匀后涂布于无菌载玻片上，经短期培养后，在低倍镜下观察是否有噬菌斑。

三噬菌体的防治发酵液中污染噬菌体，不外乎有两种原因。

1 菌种本身带噬菌体，特别是溶源性噬菌体，对这种菌种，一经发现，应立即弃去。

2 生产的环境中有噬菌体。

因此，可采取相应的预防措施：1 决不使用可疑菌种；2 清除周围环境中存在的噬菌体。

能灭菌的灭菌，能消毒的消毒，搞好清洁卫生工作；3 选育抗噬菌体菌株4 轮换使用菌株。

因为一个菌株用的时间一长，就有可能出现该菌种的噬菌体。

5 注意通气质量。

取风口应设在30~40米的高空，空气过滤器要保证质量；四发酵液污染噬菌体后的抢救措施如果一旦发现噬菌体污染，应及时采取补救措施1．若在发酵前期污染了噬菌体，因为此时耗糖还不多，常用以下措施（1）补加抗性种子，并根据发酵液中的营养多少，适当补加营养物质；（2）补加约50%的已培养至对数期的正常的发酵液，再进行发酵；（3）若噬菌体轻度污染，菌体仍能较正常地生长，并积累代谢产物，则可照常进行发酵，若污染严重，则用加热法（70~80℃）灭活噬菌体，放罐后重消毒。