工业用微生物菌种课讲义用精品

采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。
从自然界筛选
2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的 牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时 间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样 中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物 的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这— 步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用， 而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划 线分离法、稀释分离法。
稀
划
释
线
分
分
离
离
法
法
（四）筛 选
这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件， 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适 合于工业生产用菌种。
2．植物体采集方法
在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔 器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位 切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。
选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和 在一片叶上的取样部位。
3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集 日期、地点以及采集地点的地理、生态参数 等；
4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为 真正的原地菌群的出现可能是短暂的；
5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应 贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因 为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱 离了原来的生态环境，其内部生态环境就会 发生变化，微生物群体之间就会出现消长
6．根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方法，即 选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条 件；

也非常广泛。
• 该细胞株培养条件简单，贴壁强度适中，比较容易转染，很适合用它来 研究一般哺乳动物基因的功能。
• 来源：Cricetulus griseus (中国仓鼠) 卵巢 形态：
• 表皮细胞 生长特性：贴壁
• 培养液：Ham‘s F12K （含2 mM L-谷氨酰胺，1.5 g/L NaHCO3）， 10% 胎牛血清。
外源基因的导入相对容易；
已建立了整套表达理论及技术.
芽孢杆菌
芽孢形态
• 已工业化产品生产菌的介绍
3.2 真核细胞表达系统
➢3.2.1 酵母(既是微生物又是真核细胞) 生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
酵母菌形态
酵母菌菌落形态
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌
江阴市百圣龙生物工程有限公司 (原江阴市星达生化工程有限 公司)位于江苏省江阴市霞客镇。 本公司是全国酶制剂行业重 点生产企业和江苏省高新技术企业。
公司于1992年6月在中国首家引进美国先进的酶制剂菌种、 专有工艺和生产设备，专业生产耐高温α—淀粉酶、高转化率 糖化酶、中温α—淀粉酶等食品级和工业级酶制剂产品，年生 产能力8000吨。现在，本公司的产品不仅畅销国内二十多个 省、市、自治区； 1/3产品已进入欧洲、美国、东南亚等国家 和地区的市场。
现将工业上常用的微生物介绍如下
• 微生物的种类繁多， • 但工业上主要应用者主要有
• 细菌、放线菌、酵母菌及霉 菌四大类
第一节 菌种的分离简介
一、菌种的来源
• 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买；
• 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。

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(1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布 广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机 (2) 青霉属（Penicillium）：j既是使果实腐 酸。如米曲霉（ Asp. oryzae）用于酿酒和L败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄 乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬 糖酸的产生菌。 酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、 (3) 根霉属（Rhizopus）：用于米酒、黄 果胶酶、单宁酶等的黑曲霉 (Asp. niger)。 酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机 酸发酵以及甾体转化等许多方面。 (4) 毛霉属（Mucor）：产生蛋白酶，有分 解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族 化合物。土曲霉：衣康酸
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连续培养菌种的筛选 比生长速率(u):每克菌体每小时增长的 菌体量.u=1/XdX/dt.
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比生长速率u
A B
r
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基质浓度
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限 制 性 基 质
当进行流加时基质浓度<r 时,A菌先被洗出; 当进行流加时基质浓度>r 时,,B菌先被洗出;
培养液
固体培养法
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2.随机分离方法 （1）.抗生素产生菌筛选 试验菌的灵敏性，以及与抗生素有关的酶、 酶的抑制剂（例如棒酸）、激活剂、抗体 等建立起来的高灵敏度、专一的检测技术。 （2）.药理活性化合物的筛选 （3）.生长因子产生菌的筛选 （4）.多糖生产菌的筛选 （5）.免疫激活剂产生菌的分离
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(3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳 酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制 造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型 乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和 CO2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属 于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。 (4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸 脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用 大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。 医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。 另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建 基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。

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3、组成型突变株的筛选
在酶制剂的发酵生产中，常采用在发酵过程中分 批限量加入诱导物的方法，提高诱导酶的活性，为了 解除对诱导物的依赖，可通过诱变改变菌种的遗传特 性，筛选组成型突变株。突变发生在调节基因或操纵 基因，都可获得组成型突变株。
筛选的方法是设计某种有利于组成型菌株生长， 并限制诱导型菌株生长的培养条件，造成组成型菌株 生长的优势或适当的分辨两类菌落的方法，选出组成 型突变菌株。
• 3）工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）
中国食品发酵工业科学研究院，北京，（IFFI）
• 4）医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）
中国医学科学院皮肤病研究所，南京； 卫生部药品生物制品检定所，北京；中国医学科学院病毒研究所
• 5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）
中国医学科学学院抗生素研究所，北京 四川抗生素工业研究所，成都 华北制药厂抗生素研究所，石家庄
• ③ 菌种的保藏： 一切生产菌种 都要使它避免死亡和生产性能的下降， 这是菌种保藏工作的任务。
• ④ 退化菌种的复壮： 如果发现 菌种的生产性能下降，就要设法使它 恢复，这便是菌种复壮工作的任务。
一、工业微生物的菌种选育的原因
1 天然菌种生产能力低 2 生长繁殖过快
二、菌种选育的目的：改良菌种的特性，使其符合工
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第三节 杂 交 育 种 技 术
杂交育种：一般是指两个不同基因型的菌 株通过接合或原生质体融合使遗传物质重 新组合，再从中分离和筛选出具有新性状 的菌株。
理论基础－基因重组 操作方法复杂、技术要求较高，因此推广和应用受到
一定程度的限制。

第四节 分子育种
分子育种：在分子水平上，根据需要，用 人工方法取得供体DNA上的基因，在体外重 组于载体DNA上，在转入受体细胞，使其复 制、转录和翻译，表达出供体基因原有的 遗传性状

出发菌种 原种特性考察斜面或摇瓶培养孢子液来自细胞液诱变剂处理
稀释平板分离
以未处理的菌种液为对照， 计算致死率；观察单菌落形态， 统计形态变异率。
选择、挑取单菌落，转管保存
初筛 （以出发菌种为对照）
选出高产突变株，并留种保存
复筛 （以出发菌种为对照）
选出高产突变株，并留种保存
根据情况进行第二、第三……复筛 选出高产突变株，并留种保存
高产菌株的稳定性试验 菌种特性考察
高产菌种培养条件的优化试验 小发酵罐试验
放大试验、中试考查
大罐试验 生产
诱变育种应注意的几个问题
(1)出发菌株的选择 (2)复合诱变剂的使用 (3)诱变剂的剂量 (4)突变株的筛选 (5)高产突变株培养条件的优化
常用物理、化学诱变剂：
(1)紫外线 (2)快中子 (3)高频电子流 (4)Co-60 (5)亚硝酸 (6)氮芥 (7)亚硝基胍
土壤 水域(海洋、湖泊、河流) 生物体内 极端环境和特殊的生态环境
（二）材料的预处理
热处理法 膜过滤法 化学药品处理
用0.01N的NaOH处理样品，可分离 得到小单孢菌。
用4ml/L的氨水处理后，再用2mg/L 的氯处理样品，分离得到了游动放线菌。
（三）分离、筛选方案的设计
筛选模型 加选择性压力 富集培养、诱饵法 反应特性 随机分离
二、高产菌株的选育
(一)自然选育 (二)常规诱变育种 (三)合理诱变育种 (四)原生质体融合技术 (五)基因工程技术
工业菌种改良方法
(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤： （通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达 能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的 代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径）。 (2)增加前体物的浓度。 (3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高 菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐 受力。 (4)抑制或消除产品分解酶。 (5)改进菌种外泌产品的能力。 (6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结 构类似物抗性。

1.控制营养物质透过细胞膜进入细胞
如：只有当速效碳源或氮源耗尽时，微生物才合 成迟效碳源或氮源的运输系统与分解该物质的酶 系统。
2.通过酶的定位控制酶与底物的接触
1）真核微生物酶定位在相应细胞器上；细胞器 各自行使某种特异的功能；
2）原核微生物在细胞内划分区域集中某类酶行 使功能：
➢与呼吸产能代谢有关的酶位于膜上； ➢蛋白质合成酶和移位酶位于核糖体上； ➢同核苷酸吸收有关的酶在G-菌的周质区。
• 顺序诱导：即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解 各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调 节。
2 阻遏
• 定义：在微生物的代谢过程中，当代谢途径中某末
端产物过量时，阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系 列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产 物的合成。
• 阻遏作用有利于生物体节省有限的养料和能量。
一 微生物代谢过程中的自我调节
☆微生物代谢调节系统的特点：精确、可塑性强，细胞水平 的代谢调节能力超过高等生物。 ☆ 成因：细胞体积小，所处环境多变。
举例：大肠杆菌细胞中存在2500种蛋白质，其中上千种是 催化正常新陈代谢的酶。每个细菌细胞的体积只能容纳10 万个蛋白质分子，所以每种酶平均分配不到100个分子。如 何解决合成与使用效率的经济关系？
• 代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端 产物的阻遏，此即称多价阻遏作用。
• 末端产物阻遏在代谢调节中有着重要的作用，它可保证细 胞内各种物质维持适当的浓度。
（2）分解代谢物阻遏
• 定义：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在 时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶 合成的现象。
第二部分：工业微生物菌种部分
微生物技术

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三、微生物生理与遗传育种的联 系及对发酵工业的影响
1、遗传物质的确证及基本性质 确证遗传物质化学本质的三个著名实验是
转化，病毒重建及噬菌体感染实验
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(1)经典转化实验
Griffith是第一个发现转化现象的 ，虽然 当时还不知道称之为转化因子的本质是什么， 但是他的工作为后来Avery等人进一步揭示 转化因子的实质，确立DNA为遗传物质奠定
微生物生理与 遗传育种
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绪言
一. 微生物生理与遗传研究对象与任务
1. 对象: 各类工业微生物 工业微生物是指在发酵工业已经应用的或具有潜在应用价值的微生
物. 2.任务 1)微生物生理学是一门研究在实验室和自然条件下微生物生理活动特点与规
律学科 . 2)微生物遗传学是遗传学的一个分支,是以病毒,细菌,小型的真菌以及单细胞
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菌种
工业生产常用的微生物
细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆 菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
短杆菌
棒状杆菌
yeasts
精选课啤件酒pp酵t 棒母状杆菌
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T2噬菌体的实验
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(3)植物病毒重建实验
1956年Fraenkel-Conrat等用含RNA的烟 草花叶病毒进行了病毒重建实验，证实了 RNA是遗传物质。
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a 用表面活性剂处理标准TMV，得到它的蛋白质；