蛋白质分离纯化的新技术和技术要点

蛋白质分离纯化的新技术及技术要点浅述蛋白质分离纯化的新技术摘要：本文主要介绍了浊点萃取法、置换色谱法、亲和层析法、亲和色谱法、凝胶电泳、双水相萃取等蛋白质的最新分离纯化技术，综和近年来国内外的一些研究结果，结合实际应用的例子，分析了各种分离纯化方法的优点，同时指出其不足之处。

文章最后展望了蛋白质分离纯化技术的发展趋势。

关键词：分离纯化蛋白质进展生物技术的发展非常迅速，基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术，已经能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。

和其它生物产品的生产过程一样蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。

上、中游过程是运用生物技术生产目标产物，下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。

本文主要综和近年来国内外的研究结果，介绍了蛋白质的最新分离纯化技术。

2. 蛋白质的分离纯化方法：2.1 浊点萃取法(CPE)：2.1.1 概念及原理：浊点萃取法(cloud point extraction，CPE)〔1〕是近年来出现的一种新兴的液—液萃取技术，它不使用挥发性有机溶剂，不影响环境。

它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离。

目前该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中[2-5]。

CPE 法除了利用增溶作用外，还利用了表面活性剂另一个重要性质——浊点现象。

溶液静置一段时间(或离心)后会形成两个透明的液相：一为表面活性剂相(约占总体积的5％)；另一为水相(胶束浓度等于CMC)。

外界条件(如温度)向相反方向变化，两相便消失，再次成为均一溶液。

溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白，与表面活性剂的疏水基团结合，被萃取进表面活性剂相，亲水性物质留在水相，这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质分离的萃取方法就是浊点萃取。

图1显示了由温度变化引发的这种相分离现象。

温度的改变，引起水化层的破坏，增强了表面活性剂的疏水性。

2.1.2 蛋白质分离纯化中的应用：CPE 法可用于分离膜蛋白、酶、动物、植物和细菌的受体，还可以替代一些分离方法如硫酸铵分级法作为纯化蛋白的第一步，与色谱方法联用。

另外，CPE 法分离纯化蛋白质已经可以实现大规模操作。

Minuth等人成功地进行了胆固醇氧化酶浊点萃取的中试研究。

虽然使用离心分离器可以使CPE大规模连续进行，但商品离心分离器用于CPE 的效率和容量仍需进一步研究。

而且，他们发现相分离操作受时产生的表面活性物质影响较大，体系两相间密度差较小，表面张力较小，含产物的表面活性剂相的流变学行为较复杂，操作较难。

表1列出了CPE法近几年来在蛋白质分离纯化中的应用。

(1) CPE法用于分离纯化膜蛋白膜蛋白(内嵌膜蛋白、外围膜蛋白)硫水性强、难溶于水，抽提内嵌膜蛋白时，既要削弱它与膜脂的硫水性结合，又耍使它保持硫水基在外的天然状态，较难分离纯化。

由于表面活性刑具有两亲性，它一直作为腹蛋白理想的增溶剂。

增溶时，膜蛋白琉水部分嵌入胶束的硫水核中而与膜脱离，又保持了膜蛋白表面的废水结构。

相分离后，膜蛋白与表面活性剂共同析出，与亲水性蛋白质分离。

所以，CPE 法在分离纯化膜蛋白方面极有优势。

(2) 与其它分析技术的联用CPE 可以作为(HPLC)、流动注射分析(FIA)、毛细管电泳(CE)等仪器分析的样品前处理方法，提高检出灵敏度。

表面活性别可以防止样品吸附在玻璃容器上，易于与FIA中的载液及HP LC中的有机流动相或胶束流动相混合，可以直接进样。

但是在很多应用中需要除去表面活性剂后再与仪器联用。

将萃取物与表面活性剂分离的方法很多。

对于CMC＞1mM 的表面活性剂如两性离子表面活性剂可用透析法，但操作时间较长(24h左右)。

对于CMC 较小的表面活性剂可通过色谱柱分离除去，如凝胶柱、毛纫管柱等，分离出的表面活性剂可以再利用，也可以作焚烧处理。

但CPE作为HPLC 的样品前处理方法有两个缺点：第一，常用的表面活性剂在UV区域有很强的背景吸收。

第二，操作时间较长，从色谱柱上需用几个小时洗脱表面活性剂。

表面活性剂的洗脱可能会干扰分析物的测定[3]。

2.2 置换色谱法：2.2.1 概念及分离机理：置换色谱(displacement chromatography)〔6〕作为一种非线性色谱技术，是指样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂(displacer)通人色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。

样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进，使样品中各组分按作用力强弱的次序，形成一系列前后相邻的谱带，并在置换剂的推动下流出色谱柱[7]。

置换色谱的分离行为与样品组分和置换剂在实验条件下的吸附等湿线有直接的联系。

置换色谱要求样品组分及置换剂的吸附等湿线应为Langmuir 型，而且置换剂相对于被分离的各组分应有最强的吸附能力，其吸附等温线位于所有组分的吸附等温线的上方[7]，见图1(A)。

根据物料平衡方程，置换剂在柱中的移动速度uD有下列关系：式中uD 为流动相的线速，ф为相比，qD 和cD 分别为置换剂在固定相和流动相中的浓度，qD／cD 是直线OD的斜率，称之为操作线(operating line)。

当操作线的斜率小于被分离组分等温线的起始斜率，样品才能进行置换展开，最终形成如图l(中的置换序列，这是在理想的情况下(假定无轴向扩散及二次化学平衡)获得的置换色谱图。

每一组分形成矩形的平台(P lateau)洗脱峰，相邻各组分的平台洗脱峰组成了一个台阶状的色谱图。

此时，样品中不同的组分以置换剂的速度前进，即达到等速状态(isobathic co nditions)：uD＝u2；u3＝u4式中u2、u3、u4 指被置换的三组分的速度2.2.2 影响置换色谱分离的因素：（1）置换剂置换剂的选择是置换色谱能否成功地分离和纯化目标产物的关键因素之一〔7,8〕。

对于蛋白质生物大分子的置换色谱来说，多离子型的置换剂与离子交换续料相结合是目前常用的分离方式。

传统观点认为分子量相对大的聚电解质是较合适的置换剂，因为它们对固定相的结合比分离物更强，如羧甲基葡聚糖(CMD)、硫酸葡聚糖、羧甲基淀粉(CMS)〔9〕、硫酸鱼精蛋、肝素、多硫酸戊聚糖(PPS)等。

近期的研究表明，低分子量的化合物作为置换剂则更有优势，因为即使置换剂与蛋白质产物的峰有叠加，在后处理过程中，低分子量置换剂则较容易从目标产物中分离；同时，合成低分子量置换剂成本较低，色谱柱再生过程也比分子量大的置换剂快。

（2）固定相理想的固定相应具备以下条件：样品及置换剂在固定相上应有较强的吸附作用，且吸附是可逆的；样品及置换剂在固定相上的吸附等温线应为Langmuir 型；样品各组分在固定相上的吸附能力应有较大差别，以保证置换色谱带的交叠部分尽可能小而获得良好的产率；有较好的化学稳定性，可适用于不同pH 值的缓冲液和有机溶剂；有较大的比表面及吸附容量；有较好的机械强度，而且容易再生。

置换色谱中的环境不同，置换效果也不一样，即使是选用同样的硅胶，由于来源和制备方法上的差异也会影响置换效率。

反相色谱中使用的烷基硅胶柱常被应用于置换色谱。

同其它硅胶固定相相比，烷基硅胶柱由于柱容量低及非选择性吸附等缺点，很少被用于洗脱色谱，但它却可以用于置换色诺，并成功地分离了对映异构体。

1、问题：电渗纯化蛋白质，结果几乎没得到蛋白，请问哪位有高见今夜纯化蛋白，本以为唾手可得，结果却大失所望....我用SDS-PAGE分离，KCL显带，割胶，而后电渗分离，测OD 值极低，请问哪位有这方面的经验或其它方法，望赐教。

解决：多挖点胶，收集起来，放在1.5 里，用PBS捣烂，4度过夜。

然后离心，收集上清即可。

最后，把上清冻成干粉。

2、问题：蛋白质提纯的方法：SDS-PAGE and N-terminal amino acid sequence analysis.（dahuaidang）SDS polyacrylamid e gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed in 12% acrylamide and 0.1% SDS with adiscontinuous Tris-glycine buffer system. Purified enzyme was subjected to SDS-PAGE a nd electroblotted toImmobilo-PSQ 0.45μm polyv inylidene fluoride membrane (Millipore). A fter the membrane was stained withPonceau S (Sigma), the enzyme protein was cut out and washed with methanol. The mem brane strip holding the protein was subjected to automatic Edman degradation for sequenci ng of the N-terminal aminol acids using anApplied Biosystems 477A protein sequencer (Parkin Elmer).3、问题：蛋白质纯化，装柱，过柱应注意事项有哪些？（dahuaidang）现在要进行蛋白质纯化，有关装柱和过柱的注意事项有哪些呀？还有，需要测序的蛋白质样品，大概需要多少，样品要求有哪些。

柱子sephadex-200,和DEAE-纤维互素。

第一，手工装柱一般只适宜于大量蛋白质的提取。

分子筛柱一般在盐析以后用效率才高，因为它的分媛实汀Ｒ话阄叶荚蕹捎茫龋校蹋弥颍疲校蹋弥?Gelfitration column).如果手工装柱，长度应是内径的６０－８０倍，一般柱长应在1.2-2米，对于软胶，走一次柱须１２小时以上，对硬胶，也需５－６小时。

第二，仪器检测器灵敏度调整：最重要的是确定仪器工作正常，信号相应正常。

可用在检测器出口通气泡和检测器入口注射有色样品的方法确认仪器正常和估计灵敏度。

第三，均匀, 无气泡，平衡充分，分子筛要注意长度与直径比。

测序的蛋白量' 我用的方法的量是SDS-PAGE第四，如果是测序的话,跑SDS-PAGE,把染出的蛋白质带,挖下来.,直接拿去做质谱,只要你有钱国家生物医学分析中心。

还有就是要保证挖的是一个蛋白质带,不能含杂蛋白质的,不然,把杂蛋白质测了怎么办。

第五，测序跟质谱不是一回事儿的。

做质谱可以做分子量和质谱图，但是未必是序列。

序列是要单测的。

北大有位老师可以做：180块钱一个氨基酸。