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聚合酶链式反应ppt课件

聚合酶链式反应ppt课件

Extension 72˚C
Annealing
Tm-5˚C
PCR的基本过程
1.变性：将反应体系升温至95℃左右，样品中 双 链 DNA 解 开 成 两 条 单 链 ， 各 自 作 为 模 板 （待拷贝的 DNA 称为模板）。
2.退火：将温度降至引物的Tm值以下(55℃左 右)，5’端和3’端的引物各自与两条单链DNA 模板的互补区域结合。
(1944-)
1983 年提出PCR方法 1993年度诺贝尔化学奖
第一节 PCR技术的原理和特点
一、PCR基本原理
• PCR是一项DNA体外合成技术，类似于生 物体内的DNA复制过程。
• 依据DNA半保留复制的机理。 • PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。
细胞内复制的过程
1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋解 链成两条单链，各自作为模板。
RNA样品必须先经过逆转录 生成cDNA， cDNA作为PCR扩增 的模板。这个技术称为逆转录 PCR（RT-PCR）。
3. 常见的扩增对象(含核酸的标本)：
• 病原体标本：有病毒、细菌、真菌、螺 旋体、立克次体、支原体等。
• 病理生理标本：有细胞、血液、绒毛、 羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养 细胞系。
（五） Mg2+
• Mg2+：为Taq 酶的必需激活剂。 浓度为0.5~2.5mmol/L。
太少：酶活性明显降低； 太多：导致非特异性扩增。
反应温度和时间
1. 变性： 95℃，30”~1’
双链DNA变成单链。
2. 退火：55℃，30”~1’
引物与模板互补结合。退火温度对特异性影响很大。
退火温度=Tm值-(5～10℃)
5. 模板量要合适，一般为102~105拷贝。

第二节 聚合酶链反应-PPT

第二节 聚合酶链反应-PPT

第二十章 常用分子生物学技术第一节 核酸分子杂交第二节 聚合酶链反应第三节 基因文库第四节 生物芯片技术第五节 生物大分子相互作用研究技术PCR技术是1985年由美国科学家Kary B Mullis建立的体外扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等突出优点，是分子生物学技术中一项具有革命性的创举。

PCR方法被美国Science杂志评为1989年的十大科技成就之一，而Taq DNA 聚合酶被评选为象征1989年的“年分子”(the molecule of year)。

PCR创立的关键酶-Taq DNA聚合酶•分离:1969年，美国黄石国家公园温泉•分子量:94KDa•活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200 000U/mgThe Nobel Prize in Chemistry 1993"for contributions to the developments ofmethods within DNA-based chemistry"Michael SmithLa Jolla, CA, USAKary B. MullisUniversity of British Columbia Vancouver, Canada "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method""for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies"聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是在试管中模拟发生于细胞内的DNA复制过程，故又称为基因的体外扩增法。

聚合酶链反应技术PPT课件

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作用原理
• 实时荧光定量PCR常用的检测模式： • （1）TaqMan探针 • （2）SYBR GreenⅠ
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TaqMan探针方法的作用原理:
原理：利用Taq 酶的5‘→3’ 外切核酸酶活性并在 PC R过程中反应体系加入一 个荧光标记探针。
TaqMan 探针5‘端标以荧光发射基团，3’端标以荧光猝灭基团。该探针在 PCR过程中不能被延伸。当探针保持完整时，3‘端猝灭基团抑制5’发射基团的 荧光发射。
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• 定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量 PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实 现了对DNA模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重 反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点 。
• PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点； 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万 乃至百万倍, 肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中 扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情， 用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程 碑。
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• Mullis 1993•年度诺贝尔化学奖。 • PCR技术是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片段高效
扩增的技术，可检出微量靶序列（1个copy）。在模板DNA、引物和 dNTP存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 • 仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时内可扩增至100-200万 copy.

聚合酶链式反应(PCR) ppt课件

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扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反 应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)：
加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。 94℃ 30″
2. 退火 (复性) (Annealling):
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结 合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结 构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″
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PCR的原理2：
用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段， 类似于天然DNA的复制过程。
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板 5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段（只有20个 以下碱基的核苷酸的总称）为引物，在DNA聚合酶 的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸 直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目 的DNA片段得到扩增。
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PCR的原理3
PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA 聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两 侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温 退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA 片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得 我们所需的大量的特定基因片段。
PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，
而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，
这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的
种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多
数情况下，平台期的到来是不可避免的。
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双链DNA分子
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5’GGTCTGCCAGTCTAC3’
3’CAGGACTTAGTCACT5’ primer2
Sense primer vs Antisense primer
Upstream primer vs Downstream primer
Forward primer vs Reverse primer
Primer1 vs Primer2
⑦简并引物
如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸 序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或 几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。
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⑧套嵌引物（nested primers) 设计多组引物，结合位点依次位于前一组 引物之间。增加扩增产物的特异性。 13
需要的模板量极低。
理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！
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（3）快速 整个PCR过程约4小时即可完成。
（4）简便 对模板的纯度要求低。
不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定 或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。
（5）可以扩增mRNA RT-PCR：
先用逆转录酶将mRNA合成cDNA， 再以cDNA为模板进行扩增。
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⑤引物的Tm值
手工计算： Tm=（G+C)4 + (A+T)2
一般估计： 当引物中的（G+C）含量低于50% 时，复性温度低于55 oC。
实际复性温度选择低于Tm值5 oC。
适当提高复性温度可以提高引物与模板结 合的特异性，减少非特异产物的出现。
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⑥引物的浓度 一般使用终浓度各0.2mol/L。
① 热稳定性 Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高 温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。

研究生PCR聚合酶链反应.pptx

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➢ 那么，那个扩增片段才是正确的呢？我们设计的这一对引物可否用于扩增人类 GAPDH基因片段呢？
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• 12号染色体扩增出的序列是真正的GAPDH基因。 • 在下面的序列比对中，我们可以发现，X染色体上被扩增出的序列实际上是
GAPDH的加工的假基因（processed pseudogene）。 • 因此，如果我们能保证作为模板的cDNA不混杂有染色体DNA，就可以用这一
发、精斑、口腔上皮细胞 —固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化
模板DNA的浓度： 0.1～2ug/100ul体系 —PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高 —模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加
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5、Mg2+浓度
• Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 • 在一般的 PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～
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⑤引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰） — 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败
⑥引物5′端可修饰
— 引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特 异性影响不大；引物5′端碱基可不与模板
DNA 互补而呈游离状态；引物5′端最多可加10
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1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶 即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。 1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项发明之首。 1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。
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PCR的基本原理
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