春兰离体再生体系的研究

春兰离体再生体系的研究　王波刘文海　（潍坊工程职业学院花卉学院　山东青州２６２５００）　园艺与种苗＇、、　、　／　摘要：以春兰种子为外植体进行再生体系建立试验，采用正交试验方法研究基础培养基、激素浓度、天然添加物对原　球茎诱导、增殖、分化的影响，筛选出适合快繁各阶段的培养体系。研究结果表明，种子诱导原球茎的最适培养基为　１／２ＭＳ＋２．０ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．５ｍｇ／Ｌ６一ＢＡ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂７．５ｇ／Ｌ＋活性炭２　Ｏｇ／Ｌ；原球茎增殖培养基为　１／２ＭＳ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋２．０ｒａｇ／Ｌ６一ＢＡ＋１００ｍｌ／Ｌ椰乳＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂７．５ｇ／Ｌ＋活性炭２．０ｇ／Ｌ；原球茎分化培养基为　１／２ＭＳ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋１．０ｍｇ／Ｌ６一ＢＡ＋０　１ｍｇ／ＬＫＴ＋１５０ｍｌ／Ｌ椰乳十蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂７．５ｇ／Ｌ＋活性炭２．０ｇ／Ｌ。　关键词：春兰；种子；原球茎诱导　中图分类号：￥６４２．５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００５—７８９７（２０１７）２２—０００９—０２　春兰，兰科兰属植物，是我国兰花栽培历史最为悠久的种类　之一。叶带形，叶态优美；花色以绿色、淡褐黄色居多，花幽香，有　重要观赏价值＿ｌ１。由于长期无节制的乱采滥挖，野生资源已枯竭。　目前春兰常用种孑和分株法繁殖，其种子的胚多半不成熟或发　育不全，这样的种子是比较难以发芽的；自然的分株方法，繁殖　系数很低　，采取组织培养方法可以加快繁殖速度。但组织培养　中外植体的选择尤为重要，采用茎尖、侧芽等器官对母株伤害较　大，并且芽容易褐化难以启动，而采用种孑为外植体可避免母株　的损伤，对保护珍稀春兰资源具有重要的参考意义。　１材料与方法　１．１试验材料　购于山东绿圣兰业花卉科技有限公司，经人工授粉后，取其　种子。　１．２试验方法　１．２．１外植体消毒　取健壮植株上生长７－９个月未开裂的蒴呆，自来水冲洗　３０ｍｉｎ，超净台中７５％酒精消毒５ｒａｉｎ，再用０。ｌ％升汞溶液消毒　１０ｍｉｎ，无菌水冲洗。于超净台上剖开蒴果，取种子备用。　１．２．２种子预处理　根据黄磊方法　种子萌发阶段采用１０％ＮａＣｌＯ溶液处理２０ｍｉｎｏ　１．２．３种子萌发与原球茎诱导　采用三因素三水平正交试验设计确定最佳培养基和激素组　合（表１）。将预处理的种孑接种到不同的培养基中，每个蒴果接　种３瓶．每个处理重复３次，培养１５周后以原球茎诱导数量作　为观察指标。培养基为基本培养基＋ＮＡＡ＋６一ＢＡ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼　脂７．５ｇ／Ｌ＋活性炭２．０ｇ／Ｌ，ＰＨ５．５。培养条件：温度（２５±ｌ℃）。光照　强度２０００１ｘ，时间１　２ｈ／ｄ。　表１　Ｉ冉（３’）正交试验因素水平设计　＼因素　Ａ　Ｂ　Ｃ　＼　培养基类型　ＮＡＡ（ｍｇａ￣　６－ＢＡ（ｍｅ／Ｌ）　１　ＭＳ　１．０　Ｏ．５　２　１／２ＭＳ　２．０　１．０　３　改良１／２ＭＳ　４．０　２．０　１．２．４原球茎的增殖　将上述试验条件下生长良好的原球茎，用无菌镊子掰成大小　均匀的小块，接种于不同激素和天然添加物配比的培养基中（表２），　每个处理接种５个。接种后置于２５￣Ｃ，光照１２ｈ／ｄ，光照强度　２０００１ｘ条件下培养，６０ｄ后调查其增殖情况，统计新增殖的原球　茎总数。　表２原球茎增殖培养基正交试验因素水平设计　、＼因素　Ａ　Ｂ　Ｃ　＼　ＮＡＡ（ｒａｇＥ）　６－ＢＡ（ｍｇ／Ｌ）　椰乳（ｍｌ／Ｄ　ｌ　０．２　１．０　５０　２　Ｏ　５　２．Ｏ　１００　３　１．５　５．０　２００　１．２．５原球茎的分化　取生长健壮、大小均匀的原球茎接种到添加不同激素和天然　添加物配比的分化培养基中（表３），每个处理集中１Ｏ个。接种后　置于２５ｑＥ，光照１２ｈ／ｄ，光照强度２０００１ｘ条件下培养，６０ｄ后调查　其分化情况，统计原球茎分化出芽的总数。　表３原球茎分化培养基正交试验因素水平设计　＼因素　Ａ　Ｂ　Ｃ　Ｄ　＼＼　ＮＡＡ（ｍｇ／Ｄ　６一ＢＡ（ｒａｇ／Ｌ）　ＫＴ（ｍｇＤ　椰乳（ｍｌ／Ｄ　１　０．５　０．５　Ｏ　１　５０　２　１．Ｏ　１．Ｏ　Ｏ．３　１ｏｏ　３　２．Ｏ　２．Ｏ　０　５　ｌ５Ｏ　２结果与分析　２．１种子萌发与原球茎诱导　将经过１０％ＮａＣｌＯ溶液处理后的种子接种到不同基础培养　基和激素配比中，培养１５周后统计诱导率，试验结果表明（表　４），不同处理之间诱导率出现明显差异，极差分析表在所设置的　３个因素基础培养基、ＮＡＡ、６一ＢＡ，ＮＡＡ对原球茎的诱导率影响　较大，其次为６－ＢＡ和基础培养基。综合分析极差结呆，该试验最　佳培养基配比为１／２ＭＳ＋２．０ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．５ｍｇ／Ｌ６一ＢＡ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋　琼脂７．５ｇ／Ｌ＋活性炭２．０ｇ／Ｌ。　２．２原球茎增殖培养　将生长良好的原球茎接种到不同的增殖培养基中。以ＮＡＡ、　６－ＢＡ，椰乳为因素设置试验。原球茎培养１０ｄ后开始出现增殖现　象，新增原球茎黄绿色。９组试验原球茎的增殖倍数出现差异（

表　艺与种苗　表４原球茎诱导试验结果分析　试验号　Ａ　Ｂ　Ｃ　诱导率（％）　１　１　１　１　１２．３　２　１　２　２　１５　６　３　ｌ　３　３　１１．７　４　２　１　３　１２．２　５　２　２　１　２３　７　６　２　３　２　１３名　７　３　１　２　１７　３　８　３　２　３　１４．２　９　３　３　ｌ　１３．５　ＫＩ　３９．６　４１　８　４９．５　Ｋ２　４９　７　５３．５　４６．７　Ｋ３　４５　３９　３８．】　ｋ１　１　３．２　１３．９　ｌ６．５　ｋ２　ｌ６　６　１７．８　１５．６　ｋ３　ｌ５　１３　１２．７　Ｒ　３．４　４．８　３．８　５），极差分析表明所设置的３个因素基中ＮＡＡ和６－ＢＡ对原球　茎的增殖影响较大，其次为天然添加物。综合分析极差结呆，该　试验最佳培养基配比为Ｉ／２ＭＳ＋０。５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋２．０ｍｇ／Ｌ６一ＢＡ＋　１　００ｍｌ／Ｌ椰乳＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂７．５ｇ／Ｌ＋活性炭２．０ｇ／Ｌ。　表５原球茎增殖试验结果分析　试验号　Ａ　Ｂ　Ｃ　增殖倍数　ｌ　１　１　１　１　５　２　ｌ　２　２　３．１６　３　１　３　３　２．３５　４　２　１　３　２盘７　５　２　２　ｌ　４．６６　６　２　３　２　２．４１　７　３　１　２　３．０７　８　３　２　３　２．２１　９　３　３　１　２．１５　Ｋ】　７．Ｏｌ　７．４４　８．３１　Ｋ２　９．９４　１Ｏ．Ｏ３　８．６４　Ｋ３　７　４３　６．９１　７．４３　ｋｌ　２３　２．４８　２．７７　ｋ２　３　３１　３．３４　２．８８　ｋ３　２．４５　２０Ｏ　２４８　Ｒ　１．１１　１．１４　０．４　２－３原球茎分化培养条件　将生长～致且健壮的原球茎接种到不同的分化培养基中。以　ＮＡＡ、６－ＢＡ、ＫＴ、椰乳为因素设置试验。９组试验原球茎的分化率　出现较大差异（表６），试验组５原球茎分化率最高。极差分析表　明ＮＡＡ、６－ＢＡ、ＫＴ、椰乳四个因素对试验结果的顺序为ＮＡＡ＞　ＫＴ＞６～ＢＡ＞椰乳。原球茎分化最佳培养基配比为１／２ＭＳ＋Ｏ．５ｍｇ／　ＬＮＡＡ＋Ｉ．０ｍｇ／Ｌ６一ＢＡ＋０．１ｍｇ／ＬＫＴ＋１５０ｍｌ／Ｌ椰乳＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂　７．５　Ｌ＋活十生炭２．０ｇ／Ｌ。　３结论　鉴于自然条件下，春兰分株繁殖效率低，种子难以萌发的技　术难题，本研究综合春兰组织培养的诱导、增殖、分化阶段，以种　子为外植体初步建立了春兰组织培养繁殖体系。研究结果表明，　种子诱导原球茎的最适培养基为１／２ＭＳ＋２．０ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．５ｒａｇ／Ｌ６一　表６原球茎分化试验结果分析　试验号　Ａ　Ｂ　Ｃ　１）　分化率（％）　１　１　１　１　１　２０．６　２　１　２　２　２　２９．５　３　１　３　３　３　２７．１　４　２　１　３　２　４６．ｏ　５　２　２　ｌ　３　８０．５　６　２　３　２　ｌ　６４４　７　３　１　２　３　５７．６　８　３　２　３　ｌ　５０　３　９　３　３　ｌ　２　６１　Ｏ　Ｋｌ　７７．２　１２４　２　ｌ６２．１　Ｉ３５　３　Ｋ２　ｌ９０．９　１６０＿３　１５１　５　ｌ　３６．５　Ｋ３　ｌ６８．９　１５２．５　】２３．４　Ｊ６５．２　ｋｌ　２５．７　４１．４　５４　０　４５．１　ｋ２　６３．６　５３．４　５０，５　４５．５　ｋ３　５６＿３　５０　８　４１．１　５５　ｌ　Ｒ　３７．６　ｌ２．Ｏ　１２．９　ｌＯ　ＢＡ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂７．５　Ｌ＋活性炭２．０ｇ／Ｌ；原球茎增殖培养基为　Ｉ／２ＭＳ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋２．Ｏｍｇ／Ｌ６一ＢＡ＋１００ｍｌ／Ｌ椰乳＋蔗糖３０ｇ／Ｉ　＋琼　脂７．５　Ｌ＋活性炭２．０ｇ／Ｌ；原球茎分化培养基为１／２ＭＳ＋０．５ｒａｇ／　ＬＮＡＡ＋Ｉ．Ｏｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．１ｍｇ／ＬＫＴ＋１５０ｍｌ／Ｌ椰乳＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂　７．５ｇ／Ｌ＋活性炭２．０ｇ／Ｌ。　参考文献　［１］丁永康．中国兰花［Ｍ］．成都：四川科学技术出版社，２００８，８．　【２］￣ｌＪ道敏，荣维国，郝睿．国兰“绿蕙红舌”的组织培养技术【ＪＪ．安徽农业大　学学报，２０１２，３９（４）：６５６～６５９．　［３］黄磊看兰种子非共生萌发的研究［Ｊ］　中孑，２００３（６）：４０￣４１．　收稿日期：２０１

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