免疫血清学检验技术共108页文档

西南民族大学
1、免疫电泳
西南民族大学
（1）基本原理
带电的胶体颗粒在电场的作用下，定向移动的 现象称为电泳。蛋白质分子为一种两性电解质。 在一定的pH下，其所带的正负电荷相等，叫做等 电点。等电点时蛋白质在电场中不移动。当电泳 所用缓冲液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质 的氨基电离带正电荷向负极泳动，当pH大于等电 点时，蛋白质的羧基电离带负电荷向正极泳动。
西南民族大学
一般电泳所用缓冲液的pH偏于蛋白质等电 点的碱侧，故蛋白质带负电荷，在电场作用下 向正极泳动。
西南民族大学
（2）影响因素
泳动的速度和距离与蛋白质所带负电荷量、电 场强度、介质的性质、粘度及温度，以及缓冲液 的种类、pH、离子强度、电渗等因素有关。如蛋 白质所带的电荷量多，电场强度大，介质的粒度 小、吸附性小，缓冲液的离子强度较低，pH偏离 蛋白质等电点较远，琼脂的电渗作用较小，则泳 动速度快，反之则慢。
西南民族大学
再加入相应抗血清免疫扩散
西南民族大学
在最适比例处形成数条沉淀弧线。每一条 沉淀弧线，即代表一对抗原、抗体反应。并由 于抗原 (混合物中各组分)向四周扩散，而抗 体则为垂直扩散;故沉淀弧线呈弯曲弧型。
西南民族大学
西南民族大学
2、对流免疫电泳
在加有抗原、抗体的琼脂凝胶中，通电电 泳时，出现抗原、抗体向相反方向泳动的现象， 称为对流免疫电泳。
西南民族大学
一、凝 集 试 验
细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在胶乳、 白陶土、离子交换树脂和红细胞的抗原，与相立 抗体结合，在有适当电解质存在下，经过一定时 间，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验 （agglutination test)。
西南民族大学
参与凝集试验的抗体主要为IgG、lgM,又称 为凝集素。凝集试验可用于检测抗原或抗体， 最突出的优点是操作简便，深受基层工作欢迎。

动物疫病免疫抗体 血清学检测方法
2019.5.10
内容
一、血清学检测的意义 二、血清学检测内容和方法 三、血凝和血凝抑制实验 四、酶联免疫吸附实验 五、虎红平板凝集实验（初筛）
一、血清学检测的意义
动物免疫接种已经成为目前防御疫病传播的首选措施，只有给动 物进行有效的免疫接种后，才能产生一定的保护力，从而防止疫 病的侵入和蔓延。因此在群体接种疫苗前后对抗体水平进行检测， 准确了解动物疫病发生、传播和流行情况，掌握畜禽免疫抗体水 平和动物疫病保护情况， 从而更有效地采取综合防控措施。因此， 做好动物免疫抗体检测工作有着十分重要的临床意义和经济意义。
血凝素（HA） 柱状
血凝试验（HA)原理：
血凝抑制试验：
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或 其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。 这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制反应，也称血凝抑 制反应，利用这种特性设计的试验称血凝抑制试验 (HI) 。 该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。 目的：检测有无病毒感染和免疫状态。
注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。 加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易 导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。
ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下 几点：
（1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜 在15－30℃，使用前先预热仪器15－30分钟，测读 结果更稳定。各种酶标仪性能不同，使用前应详细 阅读说明书。
血凝试验操作步骤
4个100%血凝单位（即4HA100） 抗原的稀释倍数=使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数/4

经典方法，加LISS（低离子介质溶液）的方法 凝聚胺法 微柱凝胶试验（卡式配血）
———— 各有优缺点
※ 盐水法简便、快捷、价廉，但有局限性：
只能检出ABO、P、Lewis、MN等系统的抗体，此类 抗体属天然抗体，属IgM；
不能检出Rh、Kell、Kidd、Duffy等系统的抗体，此 类抗体由免疫产生，属IgG。
序 Rh-hr Kidd MNSs Duffy Diego Kell Lewis P
号 D C E c e JKa JKb M N S s Mur Fya Fyb Dia Dib K k Lea Leb P1 1 ++00+ 0 + ++0+ 0 + + 0 + 0 +0 + 0
2 +0++0 + + 0+0+ / + 0 0 + 0 +0 + 0
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
主侧交叉配血不相合的原因
患者或供者ABO血型定型不正确； 患者血清中存在同种抗体，与供者红细胞上相应抗原起反应； 患者血清中存在自身抗体，与供者红细胞上相应抗原起反应； 患者血清中白蛋白与球蛋白比例不正常引起的缗钱状假凝集； 血浆扩容剂的影响或试剂被污染等。
主侧（+）、自身（-）、抗体筛选（-），可能原因：
出现异常结果的处理办法
正反定型不一致应重新检测（应使用洗涤红细胞） 如果重新检测结果仍然异常，请资深工作人员协助 当检测结果与以往记录不一致时，应重新采集血标本 再一次检测
如果一时无法找到正反定型结果不一致的原因，患者 又需紧急输血，此时可输注Rh（D）同型的O型红细胞

抗体分子上具有特殊功能的区域，包括Fab段和 Fc段。Fab段负责与抗原结合，而Fc段则与效应 细胞或分子相互作用。
抗体的生物学功能
抗体具有中和毒素、调理吞噬、介导炎症反应等 多种生物学功能。
抗原抗体结合机制
锁钥学说
ห้องสมุดไป่ตู้01
抗原与抗体结合就像锁和钥匙一样，具有高度的特异性和互补
性。
诱导契合学说
02
抗原与抗体在结合过程中，会发生构象变化，使得两者更加紧
力。
抗原的特异性
抗原与相应抗体或致敏淋巴细胞发 生特异性结合的物质基础。
抗原的分类
根据抗原性质不同，可分为完全抗 原和不完全抗原。完全抗原具有免 疫原性和特异性，而不完全抗原仅 具有特异性。
抗体结构与功能
1 2 3
抗体的基本结构
由四条多肽链组成，包括两条重链和两条轻链， 通过二硫键连接。
抗体的功能区域
密地结合在一起。
多重识别机制
03
抗原抗体结合不仅依赖于锁钥关系或诱导契合，还涉及到电荷、
疏水作用等多重因素。
03 免疫血清制备技术
动物选择与免疫方案
动物选择
选用健康、适龄、免疫原性强的实验动物，如兔、马、羊等 。
免疫方案
根据实验需求和免疫原性质，制定合适的免疫程序，包括免 疫剂量、免疫途径、免疫次数和间隔时间等。
补体结合实验方法
补体结合试验（CFT）
在补体参与下，用已知抗原或抗体检测未知抗体或抗原的方法。该方法具有较高的敏感性和特异性。
间接补体结合试验
先用已知抗原致敏红细胞，再加入待检血清中的相应抗体，最后加入补体，观察红细胞是否溶解来判 断结果。该方法常用于检测某些病毒、立克次体等微生物的抗体。

协同凝集试验

葡萄球菌A蛋白(staphylococal protein A，简称SPA)
是大多数金黄色葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多
种哺乳动物IgG分子的Fc片结合。

SPA与IgG结合后，其Fab片暴露于外，并保持其抗体 活性。 当此被覆着特异性抗体的葡萄球菌与相应的抗原结合 时，就可互相连结引起协同凝集反应，简称COAG。

标本制备和处理：组织切片、压片、涂片、细胞 盖片；消除内源性过氧化酶


染色：间接法、直接法
显色

观察
（三）放射免疫测定（RIA）

将同位素测量的高度敏感性和抗原抗体反 应的高度特异性结合起来而建立的免疫分 析技术 可定量分析，也可定性分析 特异性强、灵敏度高、准确性和精密度好

三、中和试验

抗体、抗原分子小，在含量低时形成的抗原 抗体复合物是不可见的。 将特殊物质标记在抗体分子上，通过检测标 记分子来显示抗原抗体复合物的存在，即根 据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感 性建立的技术，称为标记抗体技术(labelled antibody technique)。

高敏感性的标记分子
荧光素 酶分子 放射性同位素

参与凝集试验的抗体主要为IgG、IgM。


凝集试验可用于检测抗原或抗体。
凝集试验可根据抗原的性质、反应的方式 分为直接凝集试验（简称凝集试验）和间 接凝集试验。
直接凝集试验

颗粒性抗原与凝集素直接结合并出现凝集 现象的试验称作直接凝集试验(direct agglutination test)
四、其他检测技术


免疫转印技术（immunoblotting）

2 用于标记的酶
用于标记的酶: 辣根过氧化物酶(HRP)、 碱性磷酸酶、 葡萄糖氧化酶 显色剂: 邻苯二胺(0PD) 、 四甲基联苯胺（TMB）、 二氨基联苯胺(DAB) 。
酶联免疫吸附试验 固相载体 包被 洗涤 试验方法 :间接法 、夹心法、双夹心法、 酶标抗原竞争法 、酶-抗酶抗体法 底物显色 结果判定
（三）影响因素
1 2 3 4 5
电解质 温度 酸碱度 振荡 杂质和异物
（四）应用及发展趋向
1 血清学试验的应用 2 血清学试验的发展趋向
二、凝聚性试验
抗原+ 相应抗体
抗原-抗体复合物
电解质
凝聚小块或沉淀物
电解质
抗体+ 相应抗原
抗原-抗体复合物
（一）凝集试验
细菌、红细胞等颗粒性抗原 吸附在载体上的抗原
反向间接血凝试验
乳胶凝集试验
猪伪狂犬病抗体监测技术
检测材料采集及处理 检测材料为血清时就按常规方法采血、分离 血清，要求无腐败；如用全血，则用针尖刺破猪 耳静脉，用吸头吸取血液1滴，直接载玻片上进 行检测。如用乳汁做检测材料时就按常规方法采 集初乳，经3000r/min离心10min，取上清 液体作待测样品。
（一）荧光抗体标记技术
用荧光素对抗体或抗原进行标记， 然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以 分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
1原理
荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被 专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观 察到荧光。荧光抗体标记技术就是将抗原抗 体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及 显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检 测技术。
1）定性试验 取被测样品（血清、全血和乳汁）、阳性血清、 阴性血清、稀释液各一滴，分置于玻片上。各加乳 胶抗原1滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1～2min， 于3～5min内观察结果。 2）定量试验 先将血清在微量反应板或小试管内作连续稀释， 各取1滴依次滴加于乳胶凝集反应板上，另设对照 同上。随后各加乳胶抗原1滴。如上搅拌并摇动， 判定结果。