荧光素酶报告实验原理

荧光素酶报告基因实验自我总结

实验原理：

目前由两个主要的应用方向：

第一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用，转录因子是一种具有特殊结构、

行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子

中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子

实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase

Assay） 是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。

第二是研究微小RNA(microRNA)对于靶基因的调控，通过生物信息学方法预测microRNA潜

在的靶基因以及干预位点序列，并设计合适的 microRNA质粒或干预片段，同时构建靶基因的

报告基因质粒，二者同时转染细胞，这是确定microRNA是否能影响（上调或下调）靶基因的

首选研究 方法。

实验流程：

1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如

pGL3-basic（转录因子与靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase质粒（微小RNA与靶基因）

2） 将要检测的转录因子表达质粒（或microRNA质粒）与报告基因质粒共转染293细胞

或目的细胞。如果此转录因子（或microRNA）能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就

会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度

可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

实验目的：研究转录因子和MicRNA对于靶基因调控的首先方法

实验步骤：

（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。

（2） 设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素

酶报告基因质粒中。

（3） 筛选阳性克隆，测序，扩增克隆并提纯质粒备用。

荧光素酶及其报告基因的应用和检测

一

生物发光

生物发光（bioluminescence）是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种特殊类型的化学发光，化学能转变为光能的效率几乎为100%。也是氧化发光的一种。生物发光的一般机制是：由细胞合成的化学物质，在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。

与荧光的区别在于

荧光：荧光检测需要激发光源，发射光的能量来源于激发光，荧光反应为瞬时反应。

发光：生物发光、化学发光，发光反应无需激发光源，发射光的能量来源于化学反应，发光有一定的持续时间。

二 荧光素酶

荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称,来自于自然界能够发光的生物。

自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感,因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前,以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛,该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。

发光机制

生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+ 、ATP、O2的参与下,催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧,产生激活态的氧化荧光素,并放出光子,产生550～580 nm 的荧光,其化学反应式如下。

这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光,其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白( GFP) 。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光,特异性很强,灵敏度高,由于没有激发光的非特异性干扰, 信噪比也比较高。

三 荧光素酶报告基因

报告基因（report gene）是一种易于检测蛋白质或酶等表达产物的基因，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。通常把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因,或与其他目的基因融合,在调控序列控制下进行表达,通过报告基因的表达产物来标定目的基因的表达状况。

双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明

1. 待测细胞在 10 cm dish 中培养至 80-90% 融合时，倾去培养液，用 2ml PBS

洗涤细胞两次；

2. 加 1ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置 1-5分钟；

3. 加入 2 ml 完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；

4. 血球计数板计数，将细胞稀释至 1×10 6 细胞/ml；

5. 取 100 μl 上述细胞稀释液加入 96 孔板，使细胞密度达到 1×10 5 个细胞/孔，混匀后于 37ºC 5% CO 2 培养 24 小时；

6. 在 3 个 1.5 ml EP 管中各加入 50 μl 无血清培养基，分别加入 0.2 μg，0.4

μg，0.8 μgpEX-1 质粒，混匀；取另一 1.5 ml EP 管，加入 150 μl 无血清 DMEM，加入1.5 μl 转染试剂，充分混匀，室温放置 5 分钟后将 150 μl 平均 3 等份对应加入含有质粒的 3个 EP 管，充分混合，室温放置 20 分钟；

7. 吸去 96 孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入 96 孔板中，混匀后，在培养箱中

温育 5 小时；

8. 吸弃转染液，加入 100 μl 完全培养液。37ºC 5% CO 2 继续培养, 24h 和 48h

观察并拍照质粒转染效果图片。

荧光素酶报告基因检测原理

荧光素酶（Luciferase）是一种常见的报告基因，用于检测基因表达水平或蛋白质交互作用等。荧光素酶报告基因检测原理主要基于荧光素酶催化氧化荧光素发光的特性，利用荧光素酶与底物荧光素结合后产生荧光的反应来检测特定基因的表达量或蛋白质相互作用。

荧光素酶基因通常被用作报告基因，它不会干扰到被测基因表达的水平或蛋白质相互作用。荧光素酶基因常与被测基因共同转染到细胞中，然后加入荧光素底物，荧光素酶与荧光素底物结合后发生氧化反应，产生荧光信号，荧光信号与荧光素酶表达量或蛋白质相互作用强度成正比。通过检测荧光信号的强度，可以精确地反映被测基因的表达量或蛋白质相互作用强度。

荧光素酶报告基因检测原理的实验步骤通常包括以下几个过程：

1. 克隆荧光素酶基因：首先需要从合适的来源（如萤火虫）中提取荧光素酶基因，并进行PCR扩增和克隆，将荧光素酶基因插入到合适的表达载体中。

2. 转染表达载体：将克隆好的表达载体转染到目标细胞中，使其表达荧光素酶基因。

3. 加入荧光素底物：加入荧光素底物，荧光素酶与荧光素底物结合后发生氧化反应，产生荧光信号。

4. 检测荧光信号：使用荧光计或荧光显微镜等设备检测荧光信号的强度，从而反映被测基因的表达量或蛋白质相互作用强度。

荧光素酶报告基因检测原理具有灵敏度高、可重复性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于基因表达分析、蛋白质相互作用研究、药物筛选等领域。同时，荧光素酶报告基因检测原理也存在一些局限性，如可能存在背景荧光干扰、荧光素底物的选择和加入量等因素会影响荧光信号的强度。因此，在实验设计和数据分析过程中需要注意控制这些干扰因素，以保证检测结果的准确性和可靠性。

荧光素酶报告基因检测原理是一种重要的基因表达分析和蛋白质相互作用研究方法，其应用前景广阔，有望在医学、生物学和药物研发等领域发挥重要作用。