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《大豆食品中异黄酮含量的测定》行业标准编制说明（征求意见稿）一、任务来源年月日，由中国食品工业协会豆制品专业委员会申请行业标准的立项，根据工业和信息化部下达的年第一季度行业标准制修订计划，批准《大豆食品中异黄酮含量的测定》推荐性行业标准的制定本标准由中国食品工业协会豆制品专业委员会组织制定工作。
二、标准的属性本标准是推荐性行业标准。
三、标准的修订原则（一）按照《食品安全法》的相关规定，对现行有关大豆异黄酮含量的测定相关标准进行梳理；（二）结合国内豆制品企业生产实际情况，参考国际相关标准；（三）统筹考虑与《食品安全国家标准豆制品》有效衔接，确保标准的适用性、广泛性、可操作性。
本标准的编写符合《标准化工作导则第部分：标准的结构和编写》。
四、标准主要内容制定情况、大豆异黄酮是一类从大豆中分离出来的具有生理活性的物质，近年来被确定为抗肿瘤作用的功能因子，能够预防和治疗乳腺癌、结肠癌和皮肤癌，改善骨质疏松，能够缓解和减轻女性更年期不适症状，同时可提高机体免疫功能，抗氧化、抗溶血、降低心血管疾病和冠心病的发生。
因此制定科学有效的大豆制品中异黄酮含量的测定方法非常重要。
目前，大豆异黄酮的检测主要有高效液相色谱法（）和高效液相色谱质谱联用法（），液质联用法具有高分辨、高分离能力且灵敏度高等优点，但仪器设备昂贵，难以普及。
法具有分离效果好、准确度高、重现性好、分析速度快和自动化程度高等优点，被广泛采用。
结合我国豆制品行业生产企业现状，采用法实验的可操作性、检测成本费用、应用的广泛性等几方面的问题综合考虑较为实际，且本标准中测定方法与其他分析方法比较具有同时测定种大豆异黄酮单体的含量的优点。
、本标准（国家大豆产业技术研发中心加工研究室）方法：标准品制备：准确称取标准品置于储液瓶中，以的比例（体积比）向其中加入二甲基亚砜()，乙腈，的甲醇溶液，充分溶液标准品，配制成的原始溶液。
单一标准品标准溶液的配制：使用的甲醇溶液将原始溶液稀释成μ的单标标准溶液。
大豆异黄酮、大豆苷、柒料木苷、柒料木素、大豆苷元的含量检验方法一、目的：建立大豆异黄酮、大豆苷、柒料木苷、柒料木素、大豆苷元的含量检验操作方法，保证分析结果的准确性。
二、依据：胶囊成品质量标准三、范围：本规程适用于本公司大豆异黄酮、大豆苷、柒料木苷、柒料木素、大豆苷元的含量检验操作四、职责：质量检验员对本标准的实施负责五、正文：1、试剂无水乙醇大豆苷、柒料木苷、大豆苷元、柒料木素标准样品：购于中国药品生物制品检定所0.1%醋酸水溶液（A液）0.1%醋酸乙腈溶液（B液）2、仪器高效液相色谱仪：附紫外检测器超声波清洗机离心机（3000r/min）色谱条件不锈钢柱色谱柱：内径4.6mm，长250mm，C18流动相：A液+B液，B液在35min内由20%的比例增至40%的比例。
流速：1mL/min进样量：20uL波长：254nm柱温：40℃3、标准溶液的配制精密称取豆苷、柒料木苷、大豆苷元、柒料木素标准样品（纯度＞98）5.0mg左右，置50.0mL容量瓶中，用80%的乙醇稀释至刻度，备用。
4、样品溶液的制备：精密称取样品1.0g左右，用80%乙醇溶解，超声处理20min后，定容至50mL，离心、过0.45um滤膜，测定。
5、计算结果X = A样× C标× 50 × 100A标× M × 1000式中：X—样品中大豆苷/柒料木苷/大豆苷元/柒料木素的含量（g/100g）—样品峰面积A样—标准品峰面积A标C—标准品的浓度（mg/mL）标M—称样量（g）样品中大豆异黄酮含量（%）=Xa+Xb+Xc+Xd（Xa、Xb、Xc、Xd分别为大豆苷、柒料木苷、大豆苷元、柒料木素的含量）。
《大豆食品中异黄酮含量的测定》行业标准编制说明（征求意见稿）一、任务来源年月日，由中国食品工业协会豆制品专业委员会申请行业标准的立项，根据工业和信息化部下达的年第一季度行业标准制修订计划，批准《大豆食品中异黄酮含量的测定》推荐性行业标准的制定本标准由中国食品工业协会豆制品专业委员会组织制定工作。
二、标准的属性本标准是推荐性行业标准。
三、标准的修订原则（一）按照《食品安全法》的相关规定，对现行有关大豆异黄酮含量的测定相关标准进行梳理；（二）结合国内豆制品企业生产实际情况，参考国际相关标准；（三）统筹考虑与《食品安全国家标准豆制品》有效衔接，确保标准的适用性、广泛性、可操作性。
本标准的编写符合《标准化工作导则第部分：标准的结构和编写》。
四、标准主要内容制定情况、大豆异黄酮是一类从大豆中分离出来的具有生理活性的物质，近年来被确定为抗肿瘤作用的功能因子，能够预防和治疗乳腺癌、结肠癌和皮肤癌，改善骨质疏松，能够缓解和减轻女性更年期不适症状，同时可提高机体免疫功能，抗氧化、抗溶血、降低心血管疾病和冠心病的发生。
因此制定科学有效的大豆制品中异黄酮含量的测定方法非常重要。
目前，大豆异黄酮的检测主要有高效液相色谱法（）和高效液相色谱质谱联用法（），液质联用法具有高分辨、高分离能力且灵敏度高等优点，但仪器设备昂贵，难以普及。
法具有分离效果好、准确度高、重现性好、分析速度快和自动化程度高等优点，被广泛采用。
结合我国豆制品行业生产企业现状，采用法实验的可操作性、检测成本费用、应用的广泛性等几方面的问题综合考虑较为实际，且本标准中测定方法与其他分析方法比较具有同时测定种大豆异黄酮单体的含量的优点。
、本标准（国家大豆产业技术研发中心加工研究室）方法：标准品制备：准确称取标准品置于储液瓶中，以的比例（体积比）向其中加入二甲基亚砜()，乙腈，的甲醇溶液，充分溶液标准品，配制成的原始溶液。
单一标准品标准溶液的配制：使用的甲醇溶液将原始溶液稀释成μ 的单标标准溶液。
NANCHANG UNIVERSITY功能食品学综述论文学院：生命科学与食品工程学院专业：食品科学与工程班级：食品科学与工程113班学号：**********学生姓名：**指导教师：***起讫日期：2014年3月至2014年4月大豆异黄酮的测定方法摘要本文在参考国内外大量文献的基础上,对大豆异黄酮的测定方法进行了系统的总结和介绍关键词：大豆异黄酮；测定方法Abstract:In reference on the basis of a large number of literature at home and abroad, this paper method of the determination of soybean isoflavones were summarized and introducedKeywords: soy isoflavones method目录摘要 (I)Abstract: (I)目录 .................................................................................................................................................. I I 1 根据紫外吸收特性检测方法. (1)1.1 紫外分光光度法（UV） (1)1.2 三波长法（three–wave length UV spectrophotometry） (1)2 根据色谱原理检测方法 (2)2.1 高效液相色谱法（HPLC） (2)2.2 高效液相色谱―质谱法（HPLC–MS） (2)2.3 气相色谱法（GC） (2)2.4 气相色谱―质谱法（GC–MS） (3)2.5 毛细管电泳法（CE） (3)2.6 薄层扫描色谱法（TLCS） (3)2.7 四标样快速测定法 (3)2.8 双向纸层析色谱法（Two–dimensional paper chromatography） (4)3 根据医学免疫检测方法 (4)3.1 时间分辨荧光免疫分析法（TR–FIA） (4)3.2 酶联免疫吸附法（ELISA） (4)3.3 放射免疫测定法 (5)4 各检测方法系统归纳和分析 (5)附：各国际组织采用的检测方法及标准 (6)参考文献 (7)大豆异黄酮（Soybean isoflavones，ISO）是一种从大豆中分离提取活性成分，具有异黄酮类化合物典型结构，包括三种游离型异黄酮苷元和九种结合型大豆异黄酮。
大豆食品中异黄酮含量1 范围本标准规定了大豆食品中异黄酮（大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄苷）含量测定的高效液相色谱法。
本标准适用于原料大豆及豆浆、豆腐、腐乳等大豆食品中异黄酮含量的测定。
本标准测试方法的线性范围：0.5μg/mL～100μg/mL。
本标准测试方法的检出限：2.5μg/kg。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义3.1 大豆异黄酮（soybean isoflavones）大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物，属于天然黄酮类物质，具有异黄酮类化合物的典型结构。
大豆中以异黄酮葡萄糖苷和相应苷元形式存在的物质，包括大豆苷（Daidzin）、染料木苷（Genistin）、大豆苷元（Daidzein）、染料木素（Genistein）、黄豆黄素（Glycitein）、黄豆黄苷（Glycitin）。
其分子式如下：大豆苷（C21H20O9）、染料木苷（C21H20O10）、大豆苷元（C15H10O4）、染料木素（C15H10O5）、黄豆黄素（C16H12O5）、黄豆黄苷（C22H22O10）。
4 原理样品经过乙腈-水溶液震荡提取，提取液经离心、浓缩后用80％甲醇定容、过滤，经高效液相色谱分析（C18柱分离），在260nm条件下测定，依据保留时间定性，用外标法定量。
5 试剂和材料本标准使用符合 GB/T 6682-2008 规定的一级水。
除另有规定仅使用分析纯试剂。
5.1 试剂5.1.1 甲醇（Methanol，CH3OH）：色谱纯。
5.1.2 乙腈（Acetonitrile，C2H3N）：色谱纯。
5.1.3 二甲基亚砜（DMSO，C2H6OS）。
5.1.4 冰醋酸（AceticAcid，CH3COOH）。
保健食品中黄酮类功效成分的LC-MS检测技术研究目的：采用液质联用技术对保健食品中黄酮类功效成分进行快速筛选,建立准确可靠的定性定量方法,为保健食品的质量标准研究提供一定的研究思路和方法示范。
所建立的方法可应用于生产企业,也可应用于检测、监管机构,从而更好地对保健食品进行质量控制和监管,打击假冒伪劣商品,规范保健食品市场。
方法：对13个含银杏叶保健食品、13个含大豆异黄酮保健食品、葛根枳棋软胶囊和蜂胶液进行示范性研究。
1、保健食品样品收集。
从市面上收集具有代表性的不同批号、不同厂家、不同包装、不同剂型同一主要原料的保健食品,按照原标准《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)收载项下的质量评价方法进行检测,判断是否为合格产品。
2、采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查保健食品中多种黄酮类化合物。
分别对色谱柱、流动相体系、数据采集模式、离子源参数和碰撞能量等参数进行优化,并通过与对照品对比、数据库匹配及文献数据分析,明确保健食品中所含的黄酮类成分。
3、采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱法建立同时测定保健食品中多种黄酮类化合物的定量分析方法。
采用负离子电喷雾选择反应监测(SRM)模式,分别对管镜补偿电压、碰撞能量和定量离子对等参数进行优化,同时进行检测限、定量限、线性范围、精密度、重复性、稳定性和加样回收率等方法学考察。
4、以相关功效成分及其含量为指标,对不同来源含银杏叶保健食品和含大豆异黄酮保健食品的差异进行比较研究。
5、对所检测的每个黄酮类化合物的裂解途径进行解析,总结黄酮类化合物电喷雾质谱(ESI-MSn)特征裂解规律,为建立黄酮类成分目标物的精确分子量、二级MS2质谱图的数据库及一定色谱条件下保留时间的数据库奠定基础。
结果：1、参照原质量标准方法进行检测,市场上部分保健食品的功效成分含量未达到企业标准中功效成分的标示量。
2、采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查了13个含银杏叶保健食品中16种黄酮类化合物、13个含大豆异黄酮保健食品中6种异黄酮类化合物、葛根枳棋软胶囊中20种黄酮类化合物及蜂胶液中16种黄酮类化合物。
保健食品中大豆异黄酮的检验方法
--------------高效液相色谱（HPLC）法
中华人民共和国食品工业标准编制说明
1．任务来源
国家标准《保健食品中大豆异黄酮的检验方法》制修订是根据全国食品工业标准化委员会的要求，由朝阳区产品质量监督检验所负责，与红牛维他命饮料有限公司协作，进行制订工作（项目编号：-T-469），根据项目内容确定了该项工作的具体方案和工作计划，按照项目要求开展工作。
2．意义
大豆异黄酮是一类具有营养学价值和治疗意义的非固醇类物质，也是目前国际上公认的安全有效的天然植物雌激素。
目前发现的大豆中天然存在的大豆异黄酮共有12种,分为游离型的甙元和结合型的糖甙两类，游离型的甙元约占总量的2%－3%，包括染料木素(Genistein),大豆黄素(Daizein)和黄豆黄素(Glycitein), 结合型的糖甙约占总量的97%－98%。
已发现大豆异黄酮是一种优良的天然抗氧化剂，具有多种生物活性，如对肿瘤、心血管疾病、骨质疏松症和更年期综合症预防与治疗作用。
因此，当前国际上特别是美国和日本对大豆异黄酮开展了大量的应用研究工作，以大豆异黄酮为主要成分的保健食品已成为一种新型畅销食品。
据统计，国内外市场上含有大豆异黄酮的保健食品达数十种之多。
主要有片剂、胶囊、口服液、饮料等。
例如，威海清华紫光科技生产的金奥力大豆异黄酮胶囊，成都中科生物技术开发有限公司生产的天雌大豆异黄酮营养片( 胶囊)、红牛维他命饮料有限公司开发的大豆异黄酮保健饮料、广东九极日用保健品有限公司生产的九极牌丽延口服液等。
美国C1ifbar公司开发出添加了大豆异黄酮的运动饮料，美国加州Imagine食品公司开发含大豆异黄酮、蛋白质、碳水化合物、23种维生素和矿物质的能量饮料。
不同的产品，大豆异黄酮的含量也不同，目前保健品市场上片剂一般每片（500mg）约含大豆异黄酮几十毫克，胶囊每粒含大豆异黄酮几十毫克，口服液饮料每一百毫升含大豆异黄酮几十到上百毫克，大豆异黄酮粉末含大豆异黄酮为每克一百到几百毫克。
国内生产含大豆异黄酮的保健食品厂家很多，有的产品标示的大豆异黄酮含量与实际含量差别很大，实际含量远小于标示含量，保健品市场有待于进一步规范。
为了保障消费者的
利益，也为企业提供更好的技术支持，因此建立一种相对统一、简便适用、经济的测定保健食品中大豆异黄酮含量的检测方法是很必要的。
3．国内外检测方法研究进展
作为一种天然有效的抗氧化剂，大豆异黄酮越来越受到重视，对其功能性研究，生物活性研究以及产品开发也是越来越广泛。
但是纯净的大豆异黄酮难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、等有机溶剂。
大豆异黄酮的性质限制了它在饮料等食品体系中的应用，但是随着保健品市场的逐渐升温，各种声称含有大豆异黄酮成分的保健品和食品越来越多，但是国家并未制定统一的检测标准，国内仅有农业部于2007年2月1日开始实施的行业标准 NY/T1252-2006《大豆异黄酮》，它主要针对大豆异黄酮产品。
卫生部出版的《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中有用HPLC法测定染料木素和大豆黄素的方法。
虽然许多学者建立了基于不同系统分析大豆异黄酮含量的方法，如紫外分光光度法，该方法简便，但特异性较差；薄层扫描法(TLCS)操作简便。
分离效果较好，但显色剂用量难于控制，人为误差较大；气相色谱法(GC)进样量少、高敏感性、高选择性、但在测定大豆黄素和染料木素时需要制备衍生物，样品制备步骤较多，耗时长；毛细管电泳法(CE)速度快，选择性高，仪器价格昂贵，难以普及；高效液相色谱-质谱联用法(LC-MS)具有无可比拟的优越性，易于定性和定量但因仪器价格昂贵，普及困难；高效液相色谱法(HPLC)测定样品范围广，样品制备步骤少，成本低，分离效率高，灵敏度好，测定结果准确，而且可有多种检测器供选择。
所以本课题组通过查询资料和调研，选择高效液相色谱（HPLC）法测定保健食品中大豆异黄酮的含量。
4．实验部分
4.1色谱条件的选择
参照国内外文献资料，选择了乙睛-水作为流动相，比较了在相同的进样量情况下，不同pH值（pH=5.0，4.0，3.5，3.0）的流动相对大豆异黄酮分离效果的影响。
在pH较高时，大豆黄素、黄豆黄素和染料木素的峰有拖尾现象，在pH值3.0时峰型较好，拖尾现象得到改善。
通过上述试验的比较，最终确定色谱流动相为：乙腈-水（pH3.0）；梯度洗脱：12%～18%乙腈，0～10min；18%～24%乙腈,10～23min；24%～30%乙腈,23～30min；30%乙腈,30～50min，
80%乙腈，50～55min。
此条件下，保留时间和峰面积比较，有较好的稳定性和重现性。
一次开机，连续运转5天，以下六个分别为第21，38，49，107，123，124针所进标样的保留时间，见表1。
表格 1 六次进样保留时间比较
单位：min
大豆苷13.377 13.350 13.332 13.374 13.373 13.300 13.35 0.23 黄豆苷14.271 14.242 14.237 14.275 14.277 14.201 14.25 0.21 染料木苷19.901 19.823 19.801 19.890 19.901 19.796 19.85 0.26 大豆黄素32.021 31.951 31.932 32.072 32.082 31.022 31.85 1.28 黄豆黄素33.336 33.303 33.292 33.362 33.382 33.275 33.33 0.13 染料木素43.739 43.524 43.507 43.815 43.822 43.497 43.65 0.36 对以大豆苷、黄豆苷、染料木苷、大豆黄素、黄豆黄素和染料木素进行波长扫描，波长范围：220nm～450nm，光谱图见附页1。
通过光谱图比较，这六种物质在260nm有最大吸收，因此选定260nm作为检测波长。
4.1.3 标准工作曲线和线性范围
配制不同浓度的标准使用液在上述色谱条件下进行HPLC测定。
线性方程和相关系数见表2和附页2。
表格 2 标准曲线数据列表
样品名称浓度(μg/mL) 峰面积线性方程相关系数
大豆苷0.2095 8.6 Y=38.20869X+4.01024 0.99999
2.0950 82.9
10.4750 408.0
41.9000 1619.7
83.8000 3192.0
125.7000 4810.9
黄豆苷0.1990 7.5 Y=34.74200X+2.31309 0.99999
1.9900 7
2.9
9.9500 350.9
39.8000 1391.8
79.6000 2754.0。
