WesternBlot所用试剂汇总

[主要试剂]1、SDS-PAGE 试剂：2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。

3、转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O 定容至1000ml。

4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O 至1000ml。

5、膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。

包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml 的0.01M PBS 中。

6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H202 1.0μl。

7、兔抗猪R 蛋白抗体、HRP 标记羊抗兔IgG（二抗）。

[操作步骤]1、蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。

然后4℃，13,000g 离心15min。

取上清液作为样品。

2、电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

3、转移（半干式转移）：（1）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3 次。

（2）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC 膜，浸入转膜缓冲液中10min。

（3）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24 层滤纸、NC 膜、凝胶、24 层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC 膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g 重物，将碳板上多余的液体吸干。

接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。

转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。

将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s 后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

1. 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g亚甲双丙烯酰胺（Bis） 1.0g混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。

2. 4×分离胶缓冲液（1mol/L Tris-Hcl PH 8.8）Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。

3. 4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-Hcl PH 6. 8）Tris 12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。

4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。

5. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用6. 10%过硫酸铵（AP）：0.1g AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。

7. 2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液0.5mol/L Tris-HCL (PH 6.8) 2ml10%SDS 4 mlβ-巯基乙醇1ml甘油2ml1%溴芬蓝1ml置4℃避光保存8. 5×电泳缓冲液（PH 8.3）：Tris 15.2g甘氨酸94gddH2O 定容到1000mlSDS 5g先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。

9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：即1×SDS-PAGE10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ：NaCl 8.5g(12H2O)Na2HPO4 2.9011g(2H2O)NH2PO4 0.24g加ddH2O定容至1000ml11. 封闭液: 1×PBS中加入30ml5%（V/V）脱脂奶粉 1.5g0.02%叠氮钠0.006g0.05%Tween-20 0.015g12. 漂洗液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS溶液每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-2013. 水饱和正丁醇：正丁醇50 mlddH2O 5 ml 加入瓶中震荡，使结合，存于室温。

WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。

1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。

1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。

1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。

1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。

1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。

1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。

8SDS-PAGE电泳适用与Bio-Rad Mini Protean 3类电泳槽一、准备工作1 试剂蛋白marker；丙烯酰胺；双丙烯酰胺；Tris碱；甘氨酸；甲醇；冰乙酸SDS；过硫酸铵；甘油；溴酚蓝；β-巯基乙醇；考马斯亮蓝R-250；TEMED；正丁醇2仪器与耗材电泳系统；移液枪；电子天平；pH计；恒温加热器；EP试管；量筒（500ml,250ml,100ml,20ml）；烧杯（500ml,50ml）；玻璃引流棒；储液瓶；二、操作步骤a.灌制分离胶(6cm×8cm×1.5mm):1. 组装好凝胶模具，确保不会发生凝胶渗漏。

2. 凝胶配制所用组分如下：按10%配制（注：先加入○1○2○3○4，然后再从冰箱取出○5○6加入）3. 加入○5APS和○6TEMED后，轻轻振荡烧杯使其混匀。

（注：一定要将加入的溶液充分混匀，以免胶凝固的不均匀）4. 小心地用移液器将分离胶沿隔片加入模具。

（注：动作缓慢，以免产生气泡）5. 当加入的凝胶溶液7.4 mL时，轻轻在溶液上覆盖一层1 mL正丁醇饱和的水，使胶面平整。

6. 等40 min，待凝胶聚合后，在分离胶和水之间会出现一个清晰的界面。

（注：此时可制备蛋白样品。

具体见“c. 样品的制备”）b. 灌制浓缩胶1.浓缩胶配制所需组分如下：按3.9%配制2.倒出并用滤纸吸干覆盖在分离胶表面的水层。

（注：先加入○1○2○3○4，然后倒出水，最后再从冰箱取出○5○6加入）3.加入○5APS和○6TEMED后，轻轻振荡烧杯使其混匀。

4.小心地用移液器将浓缩胶沿隔片加入模具，直至凝胶到达模具的顶部。

5.斜着插上梳子。

（注：动作缓慢，尽量不要产生气泡）6.放置30 min左右，待凝胶聚合后，小心拔出梳子。

（注：拔出梳子时，要垂直拨出，以免损坏制好的泳道）7.将凝胶放入电泳槽中，在槽中加入1×电泳缓冲液。

（注：1，缓冲液所加入的量，○1玻璃内液面高于玻璃外液面，○2玻璃内的，液面高于短玻璃低于长玻璃。

1.Western Blotting 相关溶液及抗体1)转膜缓冲液（running buffer）(10×)(1L)Tris 30.3g甘氨酸144g不调pH转膜工作液（1×)(1L)（现配现用）(10×)转膜缓冲液（running buffer）100ml无水乙醇100ml水800ml2)TBS 缓冲液(5×)（1L）Tris-HCl 12.15gNaCl 146.4g用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4（约5ml浓盐酸，pH试纸检测即可）TBST：TBS+Tween-20 0.1%（1ml for 1L）3) 封闭液TBST 缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3% Gelatine)4）Western Blotting 第一抗体适合于自己蛋白的抗体5）Western Blotting 第二抗体辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.实验步骤（1）SDS-PAGE 电泳分离蛋白质：(浓缩胶70V，30-40min；分离胶120V，1h)5×loading buffer: 4mlddH2O 1.76ml 1M Tris-HCl pH 6.8 0.24ml甘油1ml 10%（w/v）SDS 0.8mlß-巯基乙醇0.2ml（2）将4 张滤纸剪成与海棉大小一致的方形（3）配（1×)转膜工作液(10×)转膜缓冲液（running buffer）80ml无水乙醇80ml水640ml800ml（4）将胶泡在（1×)转膜工作液中（防止胶干掉，最好不要用水，水泡胶会涨）（5）用尺子量胶大小，裁PDVF膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）（6）PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到（1×)转膜工作液中。

（PDVF膜为疏水性的，先在乙醇中泡会使其亲水性好）（7）将海绵和滤纸在水中浸湿，然后按照一下顺序(整个操作过程中保证膜不能干)：白板—海绵—两层滤纸--PDVF膜（靠正极）--胶（靠负极）（用小试管排气泡）--两层滤纸—海绵（用小试管排气泡）--夹住—放入胶槽中（白板靠红，黑板靠黑，保证电极方向不要错）--在胶槽中加入转子—倒入（1×)转膜工作液—在胶槽中放入冰袋—80V～100V 恒压，60min(该条件可以转移25kD～90kD的蛋白)(8)封闭：在封闭液中室温，摇1h或者4℃静置过夜。

Western blot常用试剂配方1. 丙烯酰胺-双丙烯酰胺储存液：30% AB（100ml）丙烯酰胺29 g双丙烯酰胺1g加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶保存。

2. 10% SDS：（10ml）电泳级SDS 1 g蒸馏水9 ml初始PH约为7.85，用针尖蘸少许浓盐酸调PH 至7.2，定容至10ml。

3.TEMED（四甲基乙二胺）（成品）4. Lower-buffer （1.5M Tris-Cl PH 8.8）：50mlTris-base 9.085 g蒸馏水45 ml加浓盐酸（约0.4ml）调PH至8.8后定容至50ml，4℃保存。

5. upper buffer（1.0M Tris-Cl，PH6.8）：50mlTris-base 6.055 g蒸馏水44 ml加3.5ml浓盐酸调PH至6.8后定容至50ml，4℃保存。

6. 10%过硫酸铵（10% AP）：0.5ml 新鲜配制称取0.05g AP于1.5ml EP管中，储存于-20℃，用时溶于0.5ml蒸馏水7. 5 × loading buffer：（1ml）50mlupper buffer 0.312 ml 15.6ml甘油（丙三醇）0.5 ml 25mlSDS 0.1 g 5gDTT 0.0385 g溴酚蓝0.005g 0.25g加蒸馏水溶解后定容至1ml。

取0.2ml加0.8ml蒸馏水配成工作液。

8. 5 × running buffer：（1000ml）Tris-base 15.1 g甘氨酸（Glycine）94 gSDS 5 g加蒸馏水溶解后定容至1000ml。

用时加4000 ml蒸馏水。

9. 考马斯亮蓝染液：100ml（可重复利用）甲醇30 ml冰乙酸10 ml蒸馏水60 ml考马斯亮-250 0.05 g10. 考马斯亮蓝脱色液500ml：现用现配乙酸（10%）50ml甲醇（30%）150ml加蒸馏水定容至500ml。

WesternBlot准备器材和试剂Western Blot（一）2010.9.26/9.28/11.9I．每组准备（共20组）：1.小刀，剪刀，直尺，铅笔2.鸭嘴镊子及尖嘴镊子3.表面皿×2套（中号）4.滴管及10 mL吸管5.吸球，滴头，手套，塑料袋6.20 μl 100 μl 1 ml枪及枪头7.PVDF膜（2.5×7 cm）（戴手套裁）8.厚滤纸（约2.5×7 cm的6倍大小）（戴手套裁）9.HL60细胞×1瓶10.50 ml离心管11.PBS×12 mL12.4% SDS×0.3 mL13.水饱和正丁醇×1.5 ml14.30%丙烯酰胺×10ml15.4×分离胶缓冲液×6 ml16.4×浓缩胶缓冲液×3 ml17.10%SDS×0.5 ml18.10%过硫酸胺×250 μl（提前1天配制并分装）19.ddH2O×20 ml20.66 kD 蛋白质Markers×5 μl21.2×加样缓冲液×40 μl22.甲醇×25 ml23.转移缓冲液×85 ml(体积需准确)24.封闭液×30 ml(提前1天配制,4度保存)25.废物桶，废液盆II．两组共用1.百晶垂直电泳槽1套2.1×SDS-PAGE电泳缓冲液×500ml III全班另需：1.脱色摇床×42.转移电泳槽×23.进口电泳仪4.薄膜×25.考马斯亮蓝染色液1瓶×1000 ml6.脱色液I×3000 ml7.4℃大、小离心机8.沸水浴（内含水漂）9.室温台式离心机10.40℃水浴IV．讲台上：1.备用饭盒中：1.5 ml Epp、滴管、刻度吸管2. 1 ml、200 μl、10 μl加样枪及枪头3. 1.5 ml试管架，上有：蛋白质样品、66 kD 蛋白质Markers、2×加样缓冲液、Prestained Markers、4.50 ml试管架，上有：封闭液×50 ml5.TEMED6.手套7.其余备用试剂Western Blot（二）2010.9.29/9.30/11.11I．每组需（共20组）：1.剪刀、鸭嘴镊子2.塑料袋3. 1 ml加样枪及枪头4.表面皿×2套5.PBS T×150 ml6.检测缓冲液×20 mlII．全班另需：1．脱色摇床×42．卷纸×43．封口机4．塑料袋×1III．讲台上：1．冰盆，内含：抗体1、抗体2、底物液细胞总蛋白的制备及Western Blot（一）（2001年11月20日）I．每组准备（共22组）：1.饭盒中：滴管×6只10 mL吸管×6只1.5 mL Eppendorf ×62.垂直电泳槽（长玻璃板×2，短玻璃板×2，0.75 mm边条×2对，倒胶槽×1套，白色夹子×4）3.小刀，剪刀，直尺，铅笔4.鸭嘴镊子及尖嘴镊子5.50mL试管架及1.5mL试管架6.表面皿×2套（中号）7.吸球，滴头，手套8.20 μl 100 μl 1 ml枪及枪头9.一次性注射器和7号针头10.Blotter Paper（1/3张，约8.5×21 cm大小）（戴手套裁）11.PVDF膜（2.5×6 cm）（戴手套裁）12.HL60细胞×2瓶13.50 ml离心管×114.50 ml三角烧瓶×115.PBS×12 mL16.4% SDS×1.2 mL17.水饱和正丁醇×1.5 ml18.1×SDS-PAGE电泳缓冲液×500ml19.30%丙烯酰胺×15 ml20.4×分离胶缓冲液×10 ml21.4×浓缩胶缓冲液×4 ml22.10%SDS×0.6 ml23.10%过硫酸胺×1ml（临时配）24.ddH2O×25 ml25.66 kD 蛋白质Markers×5 μl26.2×加样缓冲液×50 μl27.甲醇×25 ml 28.转移缓冲液×85 ml29.封闭液×50 ml30.废物桶，废液盆II．全班另需：1.电泳仪2.脱色摇床×43.转移电泳槽×24.进口电泳仪5.薄膜×26.普通白纸×27.考马斯亮蓝染色液1瓶×1000 ml8.脱色液I×2000 ml9.脱色液II×2000 ml10.2000 ml大烧杯×111.卷纸×412.4℃大、小离心机13.沸水浴（内含水漂）14.室温台式离心机15.40℃水浴III．讲台上：1.备用饭盒中：1.5 ml Epp、滴管、刻度吸管2. 1 ml、200 μl、10 μl加样枪及枪头3. 1.5 ml试管架，上有：蛋白质样品、66 kD 蛋白质Markers、2×加样缓冲液、Prestained Markers、4.50 ml试管架，上有：封闭液×50ml5.TEMED6.手套细胞总蛋白的制备及Western Blot（二）（2001年11月22日）I．每组需（共22组）：1.剪刀、鸭嘴镊子2.塑料袋3. 1 ml加样枪及枪头4.表面皿×1套5.PBST×150 ml6.检测缓冲液×20 mlII．50 ml离心管×1：1.脱色摇床×42.卷纸×43.封口机4.塑料袋×1III．讲台上：1.冰盆，内含：抗体1、抗体2、底物液2.TE×1瓶。

Western blot 常用试剂配置1.（1）10 X SDS 电泳缓冲液（储备）Tris-base（FW 121.1，0.25M）30.3gGlycine （FW 75.1,1.92M）144.0gSDS （1% ，w/v）10.0g （SDS有毒且分子量小，易飞，称量时动作要轻柔，并带口罩）加适量去离子水磁力搅拌下溶解（不调pH），定容至1000ml，棕色瓶室温储存可以用6个月。

（2） 1 X SDS 电泳缓冲液取10 x SDS 100ml，加蒸馏水定容至1000ml，混匀备用。

2.（1）10 x 转膜缓冲液（solarbio）不含SDS可自配，配方与10 x SDS 电泳缓冲液（储备）相似，不加SDS。

Tris-base（FW 121.1，0.25M）30.3gGlycine （FW 75.1,1.92M）144.0g加适量去离子水磁力搅拌下溶解（不调pH），定容至1000ml，棕色瓶4℃储存。

（2）1 x 转膜缓冲液：10 x 转膜缓冲液100ml ＋甲醇200ml 加DW （700ml）定容至1000ml。

（可重复使用1-2次，适当补充少量甲醇）3. 20 x TBS1 x TBS-T 配置：取20 x TBS 25ml，Tween-20 500ul，去离子水定容至500ml，混匀备用。

4℃储存。

4. 10% 过硫酸铵（Ammonium Persulfate，APS，FW228.2）配置APS 0.1g +DW 1ml，混匀，分装160ul 管，4℃保存一周。

（-20℃保存时间长）5.10%封闭液配置：脱脂奶粉2.5g，加1x TBS-T 25ml,磁力搅拌20-30分钟至完全溶解，4℃短期保存。

6. 5% BSA （贵）封闭液配置：BSA（淡黄色颗粒）4℃储存，2g，加TBS-T 40ml，磁力搅拌20-30min至完全溶解，4℃短期保存。

7.β-actin 配置，1:1500，分子量大约438. 叠氮钠，1:1000稀释一抗，延缓其腐败，稀释后4℃储存，一周内用完（一般用2-3次，膜最多用2次。

三、Western blotting所需：1、1×SDS Lysis buffer：Tris-HCl(pH=6.8) 0.757gSDS 2g甘油10ml加去离子水定容至100ml。

2、RIPA Lysis buffer ：储备(1000ul)50mMTris/HCL(PH8.0)150mM NaCL1% Nonidet-P401% Sodium deoxycholate0.1%SDS0.1mM DTT(二硫苏糖醇)0.05mM PMSF1xCocktail(PMSF : Phenylmethanesulfonyl fluoride , 中文名为苯甲基磺酰氟。

现用现配，配好后应在30分钟内使用。

)3、5×SDS-PAGE电泳缓冲液储存液：甘氨酸72.05gTris碱15.15g加入去离子水定容至1000ml。

4、5×SDS 上样缓冲液Tris-HCl(PH6.8) 250mMDTT 500mMSDS 10.0%溴酚蓝 1.0%甘油50%加去离子水定容至100ml分装至1.5mlEP管中，4℃保存。

5、30%丙烯酰胺Solution 1：Acrylamide(丙烯酰胺) 29.0gBis-Acrylamide 1.0g加去离子水定容至100ml。

6、pH 8.8 Solution 2：(分离)1.5M Tris-HCl (PH8.8) 18.15g调PH至8.8，加去离子水定容至100ml，4℃保存。

7、pH 6.8 Solution 3：(积层)0.5M Tris-HCl (PH6.8) 3.0g调PH至6.8，加去离子水定容至50ml，4℃保存。

8、10%过硫酸胺(APS)：称取0.1g过硫酸铵(APS)，加入1ml去离子水溶解。

9、10% SDS溶液：称取10gSDS，加入去离子水定容至100ml，室温保存。

10、Blocking buffer（封闭液）：脱脂牛奶 2.5g加去离子水定容至50ml。

（一）Western-blot实验1. Western blot主要实验试剂溴酚蓝（Bromphenol Blue）丽春红（Ponceau S）考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue R-250）吐温-20（Tween-20）β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)十二烷基硫酸钠（SDS ）过硫酸铵（APS）TEMED聚丙烯酰胺凝胶单体贮备溶液4×浓缩胶缓冲液4×浓缩胶缓冲液甘氨酸Tris碱脱脂奶粉牛血清白蛋白（BSA）硝酸纤维素膜（NC膜）蛋白质Marker和预染Marker通用蛋白裂解/提取试剂BCA法蛋白定量试剂盒Bradford法蛋白定量试剂盒兔源性抗抗体辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgGECL超敏发光液定影液、显影液、X光胶片曝光盒其他试剂（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）2. Western-blot主要实验试剂的配制方法（1）10%SDS溶液: SDS粉末1g,加双蒸水10mL使其溶解，室温保存。

（2）10%APS：APS 20mg,加双蒸水200μL,混匀，现配现用。

（3）10×电极缓冲液（PH8.3）: SDS粉末10g、Tris碱30.4g、甘氨酸144g，双蒸水定溶至1000mL，4℃保存，用时10倍稀释。

（4）考马斯亮蓝固定液：乙醇500mL、冰醋酸10mL、双蒸水定溶至1000mL。

（5）考马斯亮蓝脱色溶液：95%乙醇250mL、冰醋酸80mL，双蒸水定溶至1000mL。

（6）考马斯亮蓝染色溶液：0.29g考马斯亮蓝,溶解于250mL脱色液中，过滤后室温保存。

（7）转移缓冲液：甘氨酸2.93g、Tris碱5.812g、甲醇200mL、去离子水定溶至1000mL，4℃保存。

（8）10×TBS溶液：Nacl87.75g、Tris碱12.1g，用双蒸水溶至1000mL，4℃保存，用时10倍稀释。

（9）TBST溶液：1×TBS溶液1000mL、Tween-20溶液1mL，混匀。