六、克隆基因的表达

起始密码子及其5端若干密码子的影响：
90%以AUG为起始密码子，少数UUG、GUG。
AUG右侧的几个密码碱基组成也有影响，不能与 mRNA的5’端非编码区形成茎环结构。
4. 生物体对密码子的偏爱性：
简并密码子使用频率在不同 不
同蛋白质翻译时不同，具有偏
➢外源基因密码子在大肠杆菌细胞中获得
最佳表达：
简单，便于基因操作和分析。
（2）多数细胞内有质粒或噬菌体，便于构建相应
表达载体， 目标基因表达水平高。
（3）代谢途径和基因表达调控机制比较清楚 （4）繁殖迅速、培养简单、操作方便 （5）被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
（三）外源基因在大肠杆菌中表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 表达载体的必要元件 密码子 质粒拷贝数
3、控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程
度 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的
拷贝数 4、优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成:限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度：较低的效表达外源基因？ 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？ 什么是RBS位点，如何影响基因表达？ 什么是包涵体？其形成机理是什么？ 融合蛋白、寡聚型异源蛋白 基因工程菌的遗传不稳定性的主要机制是什么？
➢ DNA体内重组的基本原理：同源序列依赖型
染色体DNA的两个同源区之间可发生同源重组， 其频率与细菌种类、同源程度、两个同源区之间 距离有关。
➢同源重组有整合和交换两种形式，前者只
需要一个断裂位点，后者有两个断裂位点。
标记基因
目的基因
同源交换
标记基因
目的基因
三、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策

2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
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二．原核生物基因结构和表达特点
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1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
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3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
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五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
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1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
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三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
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四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
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2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
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➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
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2
基因克 隆 Gene Cloning
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➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程

Lac和Tac表达系统是最早建立并得到广泛应用的表达系统。 大肠杆菌 JM109 等菌株常被选用为 Lac、Tac表达系统的宿主菌。
第7章 克隆基因的原核表达
lac、tac 表达系统存在的问题
IPTG （异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）用于诱导 lac、tac 启动子的转 录，但由于 IPTG 本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用 于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质 的生产工艺中不能使用 IPTG

调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平更高于 trp 和 lacUV5 启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达水平的 情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。
第7章 克隆基因的原核表达
lac、tac 启动子的宿主菌
第7章 克隆基因的原核表达
1 外源基因在原核细胞中的表达
1.1原核生物基因表达的特点 1.2 外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必 须的结构 1.3几种类型的原核表达载体 1.4提高基因表达效率的途径
第7章 克隆基因的原核表达
1.1 原核生物基因表达的特点
① 只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)：催化所有RNA的合成。 ② 基因的表达是以操纵子为单位的。 ③ 原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的 。 ④ 原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核 细胞的转录后加工系统。 ⑤ 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产 物的直接控制要慢。 ⑥ mRNA的核糖体结合位点上，含有一个起始密码子及同16S核糖 体RNA 3’末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺 乏此序列。

基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。

本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。

一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。

基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。

基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。

1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。

限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。

DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。

DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。

2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。

RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。

PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。

原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。

真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。