脯氨酸含量的测定方法

植物中脯氨酸含量的测定实验报告及结果

本实验的目的是测定植物中脯氨酸的含量。脯氨酸是一种非常重要的氨基酸，它在植物中起着调节渗透压、抗逆性、保护细胞膜完整性等多种生理功能。因此，测定植物中脯氨酸含量对于研究植物生理学和生物化学具有重要意义。

实验所需材料和仪器设备有：植物组织样品、乙醇、脯氨酸标准物质、离心机、溶液混合器、超声波清洗器、显微管、比色皿、分光光度计等。

实验步骤如下：

1.准备样品：收集植物样品后，在洁净条件下取样品约10克，稍微清洗并切碎成小片，以利于提取脯氨酸。

2.浸提脯氨酸：将植物样品放入超声波清洗器中，加入适量的乙醇，使乙醇能充分接触到样品。使用超声波清洗仪提取样品中的脯氨酸，提取时间为30分钟。

3.离心处理：将乙醇提取液离心10分钟，将上清液转移至显微管中。

4.标准曲线的制备：取不同浓度的脯氨酸标准物质，分别加入适量的乙醇，制备不同浓度（如0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL）的标准品溶液。

5.比色测定：取0.2~1.0 mL标准品溶液，分别加入10%冰醋酸溶液（2.3 mL），然后加入15%草酸溶液（2.5 mL），混合均匀。再加入0.2%法拉第试剂（0.2 mL），充分混合，并静置15分钟。测量样品的最大吸收波长为535 nm。 6.吸光度测定：使用分光光度计进行吸光度测定，按照比色皿中的液体，即可得到对应吸光度值。

7.测量样品中脯氨酸的含量：根据标准曲线上的吸光度值，可以通过光谱仪测得样品溶液的吸光度值，然后将其代入标准曲线中计算脯氨酸的含量。

通过以上步骤，我们可以测定植物中脯氨酸的含量。实验的结果按照以下格式进行记录：

表1植物样品中脯氨酸含量的测定结果

样品编号 吸光度值 脯氨酸含量(mg/mL)

--------------------------------

10.320.1

20.450.2

30.520.3

40.570.4

磺基水杨酸法

一：原理

采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其

他氨基酸的干扰，快速 简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定 的红色缩合物，用甲

苯萃取后，此缩合物在波长 520nm 处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的 高低在一定范围内与其消光度成正比。

二：试剂

1：质量分数为3%的磺基水杨酸溶液 2：甲苯

3：2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和 6mol/L 磷酸以 3︰2 混合，作为溶剂进行配制，此液 在 4℃下 2～3 日有效

4：脯氨酸标准溶液----用蒸馏水配置成100ug/ml（可以不用，看相对含量的高低就好） 三：方法

（1）脯氨酸提取 取不同处理的剪碎混匀小麦叶片 0.2～0.5g（干样根据水分含量酌 减），分别置于大试管中，加入 5ml 3%磺基水杨

酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提 10min。

（2）取出试管待冷却至室温后，吸取上清液 2ml，加 2ml 冰乙酸和 3ml 显色液，于沸水浴中加热 40min，下一步操作按标准曲线制做

方法进行甲苯萃取和比色。 （3）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下

式计算样品中脯氨酸含 量的百分数。

脯氨酸（μg/g FW 或 DW）= CV/Wa 式中 C—提取液中脯氨酸浓度（μg），由标准曲线求得；

V—提取液总体积（ml）； a—测定时所吸取的体积（ml）；

W—样品重（g）。

*****标准曲线

肇 庆 学 院

生命科学学院 生物化学 课实验报告 实验老师 李芸瑛

12级 生物科学3班5组 姓名：张鹏 学号：36实验日期：2013年11月27日

实验题目 植物中脯氨酸含量的测定 实验目的：

了解植物体内脯氨酸含量对植物抗寒性的影响，掌握标准曲线法测定蛋白质质量浓度的基本操作和722型分光光度计的试用和操作方法。

实验原理：

采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。 样品在520nm波长下比色，即可从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。

实验材料：

木瓜叶叶片

实验器材：

1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 胶头滴管；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。

实验试剂：

1.酸性茚三酮溶液：将茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热 （70℃）溶解，贮于冰箱中。

2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

3.冰醋酸。

4.甲苯。 实验步骤：

1.标准曲线的制作

（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。

（2）系列脯氨酸浓度的配制 取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液，，，，及，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。

脯氨酸含量的测定

脯氨酸是一种重要的氨基酸，由于其参与了生物体内多种代谢反应，因此在生物学、医学、食品科学等领域都具有重要的应用价值。对于脯氨酸含量的测定，常用的方法主要有生物化学法、色谱法、质谱法等。下面将详细介绍这些方法的原理和操作步骤。

一、生物化学法

生物化学法是一种常用的脯氨酸含量测定方法，其原理是利用苯酰亚胺与脯氨酸在强酸条件下的酰化反应，生成具有紫色色素的N-苯酰脯氨酸，可通过分光光度计测定其吸收光谱来确定含量。

1. 操作步骤：

（1）样品制备

将待测样品粉碎并过筛，加入盐酸或硫酸等强酸，混合均匀，常温下反应数小时，将反应溶液转移至滤袋中过滤，然后将滤液经旋转浓缩至干燥，加入适量的甲醇或氯仿等溶剂，振荡溶解，即可制备待测样品。

（2）标准曲线制备

取不同浓度的脯氨酸标准溶液，分别进行相同的处理方法，制备不同浓度的标准溶液。然后以标准溶液的吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（3）分光光度计测定

将待测样品和标准溶液分别置于分光光度计中，以标准曲线为参照，通过测定吸收光谱来确定样品中脯氨酸的含量。

二、色谱法

色谱法多用于测定含量较低的脯氨酸，其原理是利用离子交换色谱分离脯氨酸，在检测器中进行检测并计算。

将待测样品加入甲醇或氯仿等溶剂中，过滤经过滤纸，然后加入0.5N NaOH(或1N NaOH)

溶剂，混合并振荡，使脯氨酸完全转化为盐基态的氨基酸。

（2）色谱条件设置

利用离子交换色谱柱，设置流速，根据需求设置检测器(如紫外检测器)，调整溶液的pH值、离子强度等，使得脯氨酸能够被完全分离。 （3）色谱分离及检测

按照设定条件进行色谱分离，并在检测器中检测脯氨酸的吸收光谱，通过计算峰面积或峰高，来确定样品中脯氨酸的含量。

三、质谱法