第3章 氨基酸分离分析

氨基酸的分离鉴定纸层析法引言：氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于生物体的正常生理功能至关重要。

因此，准确地分离鉴定氨基酸成分对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。

纸层析法是一种简单而有效的分离和鉴定氨基酸的方法。

本文将介绍氨基酸的分离鉴定纸层析法并探讨其应用。

一、纸层析法的原理纸层析法是利用气相平衡原理进行物质分离的一种方法，其原理是根据物质在纸上各组分的相对亲疏性，通过运动距离的差异来分离物质。

在氨基酸的分离鉴定中，纸层析法通过将待测氨基酸溶液滴于纸上，然后将纸立起来，将纸的下端浸入相应的溶剂中，使得溶剂上升，通过毛细作用将氨基酸上提，最终实现氨基酸的分离和鉴定。

二、纸层析法的步骤1. 准备工作：制备纸层析板和显色剂。

2. 样品处理：将待测氨基酸溶解于适量的溶剂中，使其浓度适宜，然后滴于纸层析板上。

3. 运行纸层析：将纸层析板立起，纸的下端浸入相应的溶剂中，待溶剂上升到一定高度后，取出纸层析板。

4. 显色：将纸层析板放置于显色剂中，通过氨基酸与显色剂的反应，使得氨基酸在纸上显色。

5. 结果鉴定：根据显色的位置、颜色和强度等特征，对氨基酸进行鉴定和定量分析。

三、纸层析法的应用1. 氨基酸组成分析：纸层析法可用于分析蛋白质中氨基酸的组成，从而揭示蛋白质的结构和功能。

2. 质量控制：纸层析法可用于对食品、药品等中氨基酸含量的快速检测，保证产品质量和安全性。

3. 生物体内氨基酸代谢研究：纸层析法可用于研究生物体内氨基酸的代谢途径和代谢产物。

四、纸层析法的优缺点纸层析法作为一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法，具有以下优点：1. 简单易行：操作简单，不需要复杂的仪器设备，成本低廉。

2. 分离效果好：对于氨基酸的分离效果较好，可以得到较为准确的结果。

3. 易于观察：通过显色剂的反应，可以直观地观察到氨基酸在纸上的分离和鉴定结果。

然而，纸层析法也存在一些缺点：1. 分离效果有限：对于某些结构相似的氨基酸，纸层析法的分离效果不佳，难以实现准确鉴定。

实验一氨基酸的分离与鉴定——滤纸层析法目的要求（1）通过实验，了解氨基酸滤纸层析法的原理。

（2）掌握氨基酸滤纸层析的操作方法。

原理滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析（它也并存着吸附和离子交换作用）。

滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。

有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。

流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。

溶质在滤纸上的移动速率用R f值表示：溶质结构、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等因素都会影响R f 值。

此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。

无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定。

氨基酸纸层析图谱常用的显色剂为茚三酮或吲哚醌，本实验采用茚三酮为显色剂。

本实验用单向上行层析法作标准氨基酸的标准曲线，用双向上行纸层析法作几种已知氨基酸的层析图谱。

然后将其中的谷氨酸和天冬氨酸加以定量测定。

试剂和器材一、试剂（1）8×10-3mol/L谷氨酸和8×10-3mol/L天冬氨酸混合液。

（2）谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和丙氨酸混合液（已知氨基酸混合液）。

将以上氨基酸分别配制成8×10-3mol/L的浓度，然后混合之。

（3）茚三酮重结晶方法：茚三酮有时由于包装不好或放置不当常带微红色，需重结晶方可使用。

5g茚三酮溶于15mL热水，加入0.25g活性炭轻轻搅动，若溶液太浓不易操作，可酌量加5—10mL热水，加热30min后趁热过滤（用热滤漏斗，以免茚三酮遇冷结晶而损失），滤液置冰箱内过夜，次日晨即见黄白色结晶出现，过滤，再以1mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色瓶内保存。

（4）0.1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）：75%乙醇=2 ：38硫酸铜难溶于乙醇，将硫酸铜直接用75%乙醇溶解不能得到澄清溶液，如将硫酸铜溶液和乙醇混合后，放置过久则会有沉淀析出，因此，必须在临用前按比例混合。

氨基酸的分离鉴定纸层析法实验报告一、实验目的1、掌握纸层析法分离和鉴定氨基酸的基本原理和操作方法。

2、学习如何根据氨基酸在层析纸上的迁移率（Rf 值）来鉴定氨基酸。

二、实验原理纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

滤纸纤维上的羟基具有亲水性，能吸附一层水作为固定相，而有机溶剂作为流动相。

当有机相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相之间进行分配。

由于不同的氨基酸在两相中的分配系数不同，导致它们在滤纸上的迁移率不同，从而实现分离和鉴定。

Rf 值（比移值）是氨基酸在层析中的特征值，计算公式为：Rf ＝溶质移动的距离／溶剂移动的距离。

三、实验材料与仪器1、实验材料标准氨基酸溶液：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸。

混合氨基酸溶液。

展开剂：正丁醇：冰醋酸：水＝ 4:1:5（体积比）。

显色剂：025%茚三酮溶液。

2、实验仪器层析缸。

毛细管。

喷雾器。

烘箱。

直尺。

四、实验步骤1、准备滤纸选用一张大小合适的滤纸，在距底边 2cm 处用铅笔轻轻画一条横线，作为起始线。

2、点样用毛细管分别吸取标准氨基酸溶液和混合氨基酸溶液，在起始线上轻轻点样，每个点的直径不超过 2mm，点样后自然风干。

3、层析将滤纸垂直放入装有展开剂的层析缸中，滤纸下端浸入展开剂约1cm，注意滤纸不要与缸壁接触，盖上盖子，进行层析。

当展开剂前沿上升至距滤纸顶端约 1cm 时，取出滤纸，用铅笔标记展开剂前沿的位置，自然风干。

4、显色用喷雾器将显色剂均匀地喷在滤纸上，放入烘箱中，在 80℃左右烘 5 10 分钟，直至斑点显色清晰。

五、实验结果与分析1、测量并计算 Rf 值用直尺分别测量标准氨基酸和混合氨基酸斑点中心到起始线的距离（a）以及展开剂前沿到起始线的距离（b），计算 Rf 值。

2、结果分析根据计算得到的 Rf 值，对照标准氨基酸的 Rf 值，鉴定混合氨基酸溶液中的成分。

六、注意事项1、点样时要避免毛细管的尖端刺破滤纸，且点样量要适中，过多会导致斑点扩散，影响分离效果。

第三章氨基酸第3章氨基酸四大类生物分子中蛋白质是生物功能的主要载体，而氨基酸（amino acid）是蛋白质的构件分子。

自然界中存成千上万在的种蛋白质，在结构和功能上的惊人的多样性归根结底是由20种常见氨基酸的内在性质造成的。

这些性质包括①聚合能力，②特有的酸碱性质，③侧链的结构及其化学功能的多样性，④手性。

本章主要讲述这些性质，它们是讨论蛋白质和酶的结构、功能以及许多其他有关问题的基础。

一、氨基酸—蛋白质的构件分子（一）蛋白质的水解一百多年前就开始了关于蛋白质的化学研究。

在早期的研究中，水解作用提供了关于蛋白质组成和结构的极其价值的资料。

蛋白质可以被酸、碱或蛋白酶催化水解。

在水解过程中，逐渐降解成相对分子质量越来越小的肽段（peptide fragment），直到最后成为氨基酸的混合物。

根据蛋白质的水解程度，可分为完全水解和部分水解两种情况。

完全水解或称彻底水解，得到的水解产物是各种氨基酸的混合物。

部分水解即不完全水解，得到的产物是各种大小不等的肽段和氨基酸。

下面简略地介绍酸、碱和酶3种水解方法及其优缺点：⑴酸水解常用H2SO4或HCl进行水解。

一般6mol/L HCl，4mol/L H2SO4；回流煮沸20h左右可使蛋白质完全水解。

酸水解的优点是不引起消旋作用（racemization），得到的是L-氨基酸。

缺点是色氨酸完全被沸酸所破坏，羟基氨基酸（丝氨酸及苏氨酸）有一小部分被分解，同时天冬氨酸和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。

⑵碱水解一般与5mol/L NaOH共煮10~20h，即可使蛋白质完全水解。

水解过程中多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象，所得产物是D-和L-氨基酸的混合物，称消旋物（见本章氨基酸的光学活性部分）。

此外，碱水解所需时间较长。

因此酶法主要用于部分水解。

常用的蛋白酶有胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶或称糜蛋白酶（chymotrypsin）以及胃蛋白酶（pepsin）等，它们主要用于蛋白质一级结构分析以获得蛋白质的部分水解产物。