用Origin拟合Cu2O纳米线时间分辨荧光光谱寿命

常见测量仪器的b类不确定度（常见仪器检测送样要求）1.场发射扫描电子显微镜（FESEM）送样要求1.样品中不得含有水、有机小分子等易挥发、易分解成分。

2. 样品尽量小，最大尺寸：高15mm，直径30mm。

3.多孔或易潮解样品，需提前真空干燥处理。

4.粉末样品中不能含有铁、钴、镍等具有磁性成分，且不易被磁化。

超声分散，滴在铝箔上，干燥后送样。

5.需观察样品断面时，断面自己制备。

6.只做元素分析时，要用红外压片机把纯粉末样品压片。

不能测硼以下元素，测铂元素要事先说明。

2.射线衍射仪（RD）：测试项目常规测试、结晶度分析、取向度测试、晶粒尺寸分析、物相分析、小角衍射。

送样要求1．送样者在测试射线衍射之前，请务必事先了解晶体学的基础知识和射线衍射的基本原理。

为什么要用射线衍射仪以及测试项目（晶型、晶粒尺寸、结晶度、取向度、物相分析等）；2．送样前，请用简单易记的英文字母（如：A,B,C…）和数字（如：1，2，3…）对样品进行编号等.3．粉末样品：须充分研磨，需0.2克左右；4．片状样品：需有一个大于55mm（最佳为1515mm）平整的测试面；5.块状样品：需有一个大于55mm（最佳为1515mm）平整的测试面，如不平整，可用砂纸轻轻磨平，无厚度要求；6.纤维样品：a. 取向度测试：样品须疏理整齐，最少需长约30mm，直径约3mm一束纤维（大约圆珠笔芯大小的一束丝）；b.常规测试、结晶度、晶粒尺寸：样品须充分剪碎，呈细粉末状，需0.2克左右(大约一分钱硬币的体积)；7.液体样品不能测试；3.小角射线散射（SAS）送样要求1．粉末样品：须充分研磨，需0.2克左右；2．片状样品：样品表面平整，可折叠制样，最佳厚度为1mm；3．液体样品：浓度极低的稀溶液，大约需要50μL，120 mm2；4. 纤维样品：一束梳理整齐的纤维，长度5 cm, 纤维束直径2mm;不符合以上送样要求，不能保证数据的准确性。

数据处理请根据小角射线散射数据处理方法将数据按照其步骤导入origin软件中分析作图。

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二、基本操作
2.2 子窗口操作 Origin 是 一 个 多 文 档 界 面 （ Multiple Document Interface）MDI应用程序，在其工作 空间可以打开多个子窗口，这些子窗口只能由 一个是处于激活状态的，一切的子窗口操作都 是对当前激活状态的子窗口而言。对子窗口的 操作主要包括打开、重命名、排列、视图、删 除、刷新、复制和保存等。 各操作将结合具体实例向大家介绍。
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2.3 数据浏览 Origin的Tools工具栏提供了几种工具，用 来在数据曲线上浏览数据。如下：
Data Display Data Selector 动态显示所选数据点或屏幕点的XY坐标 值 选择一段数据曲线，作出标志（一是用鼠 标，二是利用Ctrl,Ctrl+Shift与左右箭头的 组合） 读取数据曲线上的选定点的XY值 读取绘图窗口内选定点的XY值 局部放大曲线 缩放
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1.2 菜单栏 菜单栏的结构取决于当前的活动窗口
工作表窗口菜单 绘图窗口菜单 矩阵窗口菜单
当前窗口为工作表窗口、绘图窗口或矩阵 窗口时，主菜单及其各子菜单的内容并不完全 相同，而是与当前窗口的操作对象有关。

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菜单简要说明： File 文件功能操作 打开文件、输入输出数据图形等 Edit 编辑功能操作 包括数据和图像的编辑等，比如 复制、粘贴、清除等，特别注意undo功能 View 视图功能操作 控制屏幕显示, Plot 绘图功能操作 主要提供5类功能: 1、几种样式的二维绘图功能，包括直线、描点、 直线加符号、特殊线／符号、条形图、柱形图、 特殊条形图／柱形图和饼图 2、三维绘图 3、气泡／彩色映射图、统计图和图形版面布局 4、特种绘图，包括面积图、极坐标图和向量 5、膜板：把选中的工作表数据到如绘图模板

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例子（2）浓度
，图中纵坐标In(I/I0)为荧光强度的对数值.从图4可以看出，光 致荧光强度的衰减呈现明显的指数下降趋势，具有典型的光致
荧光特征通过拟合光致荧光强度衰减曲线，可以计算出不同Er
浓度玻璃的荧光寿命τ 随Y浓度的变化，
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例子（3）
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• 对于不同B3+掺杂量的Zn2.85(P1-x/2 O4)2:Mn2+0.15, B3+x 样 品,我们还测定了它们的余辉性能,图5给出了各个样品 的余辉衰减曲线。从图中可以看出, B3+的共掺杂增加 了样品的余辉性能,随着掺杂量的增加其余辉性能也随 之增强,当B3+掺杂量达到x=0.10时样品的余辉性能明显 增大,继续增加B3+的含量其余辉性能则有所降低。这 是由于B3+的不等价取代使得基质中引进了外部缺陷作 为电荷俘获中心,从而增加了材料的余辉性能,而当B3+ 掺杂量过高时反而导致样品的结晶度降低从而影响其 余辉性能。
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研究荧光寿命的意义 （5）非辐射能量转移、时间分辨荧光各向异
性等主要荧光技术都离不开荧光寿命测定。 （6）在材料研究中，测量材料的荧光寿命，
可以获得能级结构和激发态弛豫时间等信息。
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• 3荧光寿命的影响因素包括哪些
• 根据激发态寿命理论，物质的荧光寿命主要由自发辐 射跃迁寿命和无辐射跃迁寿命来决定。自发辐射寿命 与温度无关，但对环境的扰动敏感。在环境扰动下， 例如，和体系的任何其它分子碰撞，体系可能通过非 辐射过程失去其电子的激发能量。任何一种趋于和自 发发射过程相竞争的过程都会降低激发态寿命。在实 际体系中，物质的荧光寿命要比由积分吸收强度得到 的自发辐射寿命下短。在有其它竞争消激发过程存在 的情况下，实际荧光寿命为τN=I/(Kf+∑Kt)。这里k，是 第t个竞争过程的速率常数。

时间相关单光子计数法测量荧光寿命（一）实验目的与要求目的：1、了解时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理和方法2、学习时间相关单光子计数荧光光度计的使用方法要求：1、掌握时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理；2、理解荧光寿命测量在物质定性及定量分析中的应用；3、了解时间分辨荧光光光度计的基本组成，各部件的作用；4、学习利用Origin软件处理实验数据。

（二）实验原理1 时间相关单光子计数器工作原理TCSPC（Time-Correlated Single Photon Counting）是目前主要应用的荧光寿命测定技术。

1975 年由PTI(Photon Technology International) 公司首先商品化，此外，Edinburgh Instruments、IBH、HORIBA 等公司也在生产基于TCSPC 的时间分辨荧光光谱仪。

TCSPC 的工作原理如图1 所示，光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号，该信号通过恒分信号甄别器1 启动时辐转换器工作，时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号。

另外，光源发出的脉冲光通过激发单色器到达样品池，样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终止光电倍增管，由此产生的电信号经由恒分信号甄别器2 到达时幅转换器并使其停止工作。

这时时幅转换器根据累积电压输出一个数字信号并在多道分析仪(Multichannel Analyzer) 的相应时间通道计入一个信号，表明检测到寿命为该时间的一个光子。

几十万次重复以后，不同的时间通道累积下来的光子数目不同。

以光子数对时间作图可得到如图2 所示直方图,此图经过平滑处理得到荧光衰减曲线。

图1 TCSPC 的工作原理简图图2 时间相关单光子计数2 荧光寿命及其含义假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n 0个荧光分子到其激发态，处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。

假定两种衰减跃迁速率分别为Γ和k nr ，则激发态衰减速率可表示为)()()(t n k dtt dn nr +Γ-= 其中n (t ) 表示时间t 时激发态分子的数目，由此可得到激发态物种的单指数衰减方程。

式中：tj＝to＋tj0 得到光检测方程
λ（t）＝ αI（t） 式中：α 是比例系数。说明光电子发射概率密度与光场瞬时强度成正比。
三、时间相关的单光子计数方法TCSPC
降低激光功率，使每一个激光脉冲所含能量足够小，以至于每次激发样 品时或者仅有１个荧光光子到达探测器的光阴极，或者没有。假如100个 激光脉冲激发样品，所发出的荧光光子仅能使光阴极平均发射１个光电 子。光子q重概率密度则变成单个光电子概率密度：
dn2(t)/dt=-(dn21/dt)sp=-A21n2(t) n2(t)= n2(0)e -A21n2(t)
定义粒子数密度由t=0时的n(0)衰减到它的1/e时所用的时间为E2能级的平 均寿命τ。
τ=1/A21
一、荧光寿命的概念
假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n0 个原子到其激发态,处于激发态的 原子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为Γ 和knr ,则激发态衰减速率可表示为
荧光寿命测定方法
一、荧光寿命的概念 二、测定荧光寿命的几种方法 三、时间相关单光子计数方法TCSPC 四、TCSPC技术优缺点 五、荧光寿命测定中可能存在的问题
自发跃迁几率：发光材料在单位时间内，从高能级上产生自发辐射的发光粒子数密度占高能级总粒子数密度的比值
一、荧光寿命的概念
一、荧光寿命的概念 假如100个激光脉冲激发样品，所发出的荧光光子仅能使光阴极平均发射１个光电
• 实际测定中,必须调节样品的荧光强度,确保每次激发后最多只有 一个荧光光子到达终止光电倍增管。否则会引起“堆积效应” (Pileup Effect)；
• 对于量子效率较高的样品，需要限制激发光强度，即减小多个光 电子同时到达的概率；
• 这种方法所用仪器结构复杂、价格昂贵、而且测定速度慢,无法满 足某些特殊体系荧光寿命测定的要求。

别.
例子（5）浓度增长，寿命减小
• 在 347 nm 激发、监测 575 nm 旳条件下，测量 Ba3La1-x( PO4)3:xDy3+系列样品旳旳衰减曲线，如 图 5 所示。衰减曲线与单指数函数I =I0exp(-t /τ) 符合得很好，I0是t = 0 时旳荧光强度，τ是荧光寿 命。x =0.04，0.08，0.10，0.15相应旳荧光寿命 分别为 0.881，0.804，0.733，0.680 ms。伴随 Dy3 +掺杂浓度旳增长，荧光寿命逐渐减小。
• 式中τ为荧光寿命。荧光强度正比于衰减旳激发态分子 数,所以可将上式改写为:
• I(t) = I0exp(- t/τ) (3)其中I0 是时间为零时旳荧光强度。 • 于是,荧光寿命定义为衰减总速率旳倒数:
• τ= (Γ+ knr)- 1(4) •也就是说荧光强度衰减到初始强度旳1/e时所需要旳时 间就是该荧光物种在测定条件下旳荧光寿命。实际上 用荧光强度旳对数对时间作图,直线斜率即为荧光寿命 倒数旳负值。荧光寿命也能够了解为荧光物种在激发 态旳统计平均停留时间。
假如激发态分子只以发射荧光旳方式丢失能量，则荧光寿命与荧光发射速率 旳衰减常数成反比，荧光发射速率即为单位时间中发射旳光子数，所以有 F 1/KF。KF是发射速率衰减常数。
F表示荧光分子旳固有荧光寿命，kF表示荧光发射速率旳衰减常数。
处于激发态旳分子，除了经过发射荧光回到基态以外， 还会经过某些其他过程(如淬灭和能量转移)回到基态，其 成果是加紧了激发态分子回到基态旳过程(或称退激过程) ，成果是荧光寿命降低。
• 研究荧光寿命旳意义 • （3）除了直接应用之外,荧光寿命测定还是其他
时间辨别荧光技术旳基础。例如基于荧光寿命 测定旳荧光猝灭技术能够研究猝灭剂与荧光标 识物或探针相互接近旳难易,从而对所研究体系 中探针或标识物所处微环境旳性质作出判断。

2012年第06期吉林省教育学院学报No.06，2012第28卷JOURNAL OF EDUCATIONAL INSTITUTE OF JILIN PROVINCEVol .28（总282期）Total No .282收稿日期：2012—02—24作者简介：徐凯（1991—），男，浙江淳安人，浙江海洋学院，在读本科生。

研究方向：电气工程及其自动化。

毛洋斐（1991—），男，浙江江山人，浙江海洋学院，在读本科生。

研究方向：电气工程及其自动化。

张艳春（1956—），女，辽宁阜新人，浙江海洋学院，高级实验师。

研究方向：电子工程信息。

周桂云（1960—），女，吉林省吉林市人，浙江海洋学院，高级实验师。

研究方向：英语与计算机。

基于Origin7．5拟合发光二极管的阈值电压测普朗克常量数徐凯1，毛洋斐2，张艳春3，周桂云4（1、2、3、4.浙江海洋学院机电学院，浙江舟山316000）摘要：本文采用数字万用表测量LED 灯的伏安特性，利用Origin7．5软件快速准确处理实验数据，确定LED 灯的正向阈值电压，再确定与阈值电压对应的LED 灯光的波长，应用公式计算出普朗克常量。

关键词：LED 灯；普朗克常量；Origin7．5；非线性曲线拟合中图分类号：TP319文献标识码：A文章编号：1671—1580（2012）06—0152—02引言：在大学物理实验中通常测定普朗克常量的实验都是以光电效应为原理的，实验时需要操作普朗克常量测定仪，这种仪器的光源采用的是高压汞灯，而高压汞灯具有价格较昂贵，使用寿命短等缺点。

故本实验介绍不同发光波长的LED 灯（发光二极管），对其进行伏安特性测量，并间接计算出普朗克常量数的方法。

1仪器用具：红、黄、绿LED 灯各1只（参数如表1）；数字万用表2只；直流稳压源1台；YL －1B 型实验板（1K Ω滑动变阻器1只，1K Ω电阻1只）；开关一个；导线若干。

表1常见发光二极管的相关参数发光二极管（LED 灯）（尺寸为引脚：＞20mm ，直径：3mm ，电流：I =20mA ）名称电压U （v ）波长λ（nm ）范围取波长λp （nm ）红光二极管2．0 2．8620 650635黄光二极管2．0 2．8590 595593绿光二极管2．0 2．8515 5355252原理与方法2．1实验原理：LED 灯（发光二极管）是一种能把电能直接转换成光能的特殊半导体器件，其核心是PN 结。

第18卷　第2期核电子学与探测技术Vo l.18N o.21998年3月N uclear Electr onics &D etectio n T echno lo gy M ar ch 1998时间相关单光子计数荧光寿命测量中数据获取和处理龚达涛　刘天宽　虞孝麒　沈广德　施朝淑　邓杰　杨炳忻(中国科学技术大学近代物理系,合肥,230027) 本文介绍了时间相关单光子计数荧光寿命测量中的数据获取系统和数据分析方法。

关键词:时间相关单光子计数　荧光寿命　最小二乘曲线拟合　多指数函数拟合1　引言时间相关单光子计数技术[1]是测量纳秒级荧光寿命的一种方法,具有时间分辨好,灵敏度高等优点,在物理学、化学、生物医学等领域有广泛的应用。

下面介绍我校物理系和近代物理系合作建立的一套时间相关单光子计数荧光寿命测量系统中的数据获取系统和数据处理方法。

图1　脉冲放电光源作为激发源的荧光谱仪的系统组成框图2　数据获取系统使样品产生荧光的激发源可以是激光、脉冲放电光、同步辐射光、放射源等。

图1是脉冲放电光源作为激发源的荧光谱仪的系统组成框图。

激发光单色仪和荧光单色仪分别选取合适波长的激发光和出射荧光。

调节光通量使进入光电倍增管的荧光为单光子。

样品发射荧光经光电倍增管、快放大器、恒比定时甄别器作为时幅变换器(TAC )的启动信号(START ),脉冲光源的光经光电倍增管、快放大器、恒比定时甄别器、延时器作为TAC 的停止信号(ST OP)。

用荧光作T AC的启动信号可避免有激发光无荧光时T AC 超时引起的死时间。

模数变换器(ADC )、微机输入接口卡和微计算机组成了计算机化的多道分析器,用以测量样品的荧光衰变时间谱。

微机输入接口卡还通过对两个恒比定时甄别器的输出信号计数来测量激发光和荧光的计数率,以监测样品的荧光激发效率。

其中微机输入接口卡是我们自行研制的。

荧光谱仪的时间分辨主要由光电倍增管、快脉冲放大器、恒比定时甄别器、TAC 、ADC 等部件的时间晃动决定。

第一章Origin基础知识Origin是美国Microcal公司出的数据分析和绘图软件,现在的最高版本为7.0 /特点：使用简单，采用直观的、图形化的、面向对象的窗口菜单和工具栏操作，全面支持鼠标右键、支持拖方式绘图等。

两大类功能：数据分析和绘图。

数据分析包括数据的排序、调整、计算、统计、频谱变换、曲线拟合等各种完善的数学分析功能。

准备好数据后，进行数据分析时,只需选择所要分析的数据,然后再选择响应的菜单命令就可.Origin的绘图是基于膜板的,Origin本身提供了几十种二维和三维绘图模板而且允许用户自己定制模板.绘图时,只要选择所需要的膜版就行。

用户可以自定义数学函数、图形样式和绘图模板；可以和各种数据库软件、办公软件、图像处理软件等方便的连接；可以用C等高级语言编写数据分析程序，还可以用内置的Lab Talk语言编程等。

一、工作环境1.1工作环境综述类似Office的多文档界面，主要包括以下几个部分：1、菜单栏顶部一般可以实现大部分功能2、工具栏菜单栏下面一般最常用的功能都可以通过此实现3、绘图区中部所有工作表、绘图子窗口等都在此4、项目管理器下部类似资源管理器，可以方便切换各个窗口等5、状态栏底部标出当前的工作内容以及鼠标指到某些菜单按钮时的说明工作表矩阵绘图1.2 菜单栏菜单栏的结构取决于当前的活动窗口工作表菜单绘图菜单矩阵窗口菜单简要说明：File文件功能操作打开文件、输入输出数据图形等Edit编辑功能操作包括数据和图像的编辑等，比如复制粘贴清除等，特别注意undo功能View视图功能操作控制屏幕显示,Plot绘图功能操作主要提供5类功能:1、几种样式的二维绘图功能，包括直线、描点、直线加符号、特殊线／符号、条形图、柱形图、特殊条形图／柱形图和饼图2、三维绘图3、气泡／彩色映射图、统计图和图形版面布局4、特种绘图，包括面积图、极坐标图和向量5、膜板：把选中的工作表数据到如绘图模板Column列功能操作比如设置列的属性，增加删除列等Graph图形功能操作主要功能包括增加误差栏、函数图、缩放坐标轴、交换X、Y轴等Data数据功能操作Analysis分析功能操作对工作表窗口：提取工作表数据；行列统计；排序；数字信号处理（快速傅里叶变换FFT、相关Corelate、卷积Convolute、解卷Deconvolute）；统计功能（T －检验）、方差分析（ANOA V）、多元回归（Multiple Regression）；非线性曲线拟合等对绘图窗口：数学运算；平滑滤波；图形变换；FFT；线性多项式、非线性曲线等各种拟合方法Plot3D 三维绘图功能操作根据矩阵绘制各种三维条状图、表面图、等高线等Matrix矩阵功能操作对矩阵的操作，包括矩阵属性、维数和数值设置，矩阵转置和取反，矩阵扩展和收缩，矩阵平滑和积分等Tools工具功能操作对工作表窗口：选项控制；工作表脚本；线性、多项式和S曲线拟合对绘图窗口：选项控制；层控制；提取峰值；基线和平滑；线性、多项式和S曲线拟合Format格式功能操作对工作表窗口：菜单格式控制、工作表显示控制，栅格捕捉、调色板等对绘图窗口：菜单格式控制；图形页面、图层和线条样式控制，栅格捕捉，坐标轴样式控制和调色板等Window窗口功能操作控制窗口显示Help帮助二、基本操作作图的一般需要一个项目Project来完成，File→New保存项目的缺省后缀为：OPJ自动备份功能：Tools→Option→Open／Close选项卡→“Backup Project Before Saving”添加项目：File→Append刷新子窗口：如果修改了工作表或者绘图子窗口的内容，一般会自动刷新，如果没有请Window→Refresh第二章简单二维图2-1输入数据一般来说数据按照X Y坐标存为两列，假设文件为sindata.dat,如下格式：X sin(x)0.0 0.0000.1 0.1000.2 0.1990.3 0.296…………输入数据请对准data1表格点右键调出如下窗口，然后选择Inport ASCII找到sindata.dat文件打开就行2-2、绘制简单二维图按住鼠标左键拖动选定这两列数据,用下图最下面一排按钮就可以绘制简单的图形，按从左到右三个按钮做出的效果分别如下:2-3设置列属性双击A列或者点右键选则Properties,这里可以设置一些列的属性。

一
打开 Ｏ ｒ ｉ ｇ ｉ ｎ ９ ． ０ ， 点击 Ｎ ｅ ｗ — Ｐ ｒ ｏ ｊ ｅ ｃ ｔ ， 新 建 一 个 工程 ， 将 实验 测得 的时 间 与 捕 获 的荧 光 光 子 数值 输入 ， 点击 Ｇ ｒ ａ ｐ ｈ菜 单 中 Ａ ｄ ｄ Ｐ ｌ ｏ ｔ ｔ ｏ Ｌ ａ ｙ ｅ ｒ中 的 Ｓ ｃ ａ ｔ ｔ ｅ ｒ 选项 ， 设 置好 Ｘ ， Ｙ轴 后 ， 出现绘 图 Ｇ ｒ ａ ｐ ｈ窗
３ 实 验 数 据 处 理
３ ． １ 数 据输 入 。 调 用绘 图 窗 口
态荧 光光 谱 后 ， 再 利 用 自身测 得 的仪 器 校 准 Ｉ Ｒ Ｆ
函数谱线 与测得 的瞬态光谱合并用 软件进行拟
合， 拟合 过程 中一般 采用 指数 多项式 进行 拟合 ， 指
数 多项式 中每 出现 一个 指数项 就代 表样 品 中存 在
中图 分 类 号 ： Ｏ ４ － ３ ９
时 间分 辨荧 光光谱 能够 有效 地表征 待测 样 品 载流 子寿命 等 物 理 参 数 。Ｃ ｕ Ｏ是 一 种本 征 的直 接带 隙 Ｐ型氧化 物 ， 它 具有优 良的光 电特性 ， 其带 隙位 于 ２ ． ０～ ２ ． ２ ｅ Ｖ之间 ， 其 室 温 下 激 子束 缚 能
总 体较 吻合 ， 但是 仍然 在 （ 一 ｒ 丁 下 ） 衰 减 下 降 曲线 的部 分有 不 吻合 的部 分存 在 ， 此 时 拟合 得 到 的寿 命值 有很 大 的误差 。 因此 ， 再利 用 三项 指 数 拟 合 函数 Ｅ ｘ ｐ Ｄ ｅ ｃ ３进 行 拟合 ， 如式 （ ３ ） ， 拟 合结 果 如 图
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
码
将得 到 的生长 在铜 箔 基 底上 Ｃ ｕ Ｏ纳米 线 样

第21卷　第3期大学化学2006年6月O r i g i n用于物理化学实验数据的非线性拟合胡玮　曹红燕(湖北大学化学与材料科学学院　武汉430062) 摘要　在物理化学实验数据处理中应用O rigin软件对数据进行非线性拟合,介绍用O rigin求得实验曲线的非线性拟合参数的方法。

,使用该软件能降低数据处理的随意性,减少处理误差,并且快捷方便,使实验结果更合理。

在物理化学实验数据处理中,计算机的使用越来越频繁,一些数据处理软件,如M icr os oft Excel和O rigin等广泛地应用到实验数据处理过程中,提高了数据处理效率和准确性。

物理化学实验数据处理过程一般为:对实验数据作图或对数据经过计算后作图→作数据点的拟合线→求拟合直线的斜率或曲线上某点的切线→根据斜率求物理量。

这一过程可以用计算机处理完成,并能克服手工绘图费时费力、偶然性较大、误差大的缺点。

目前,应用M icr os oft Excel和O rigin对数据点的线性拟合和数据绘图文献报道较多,而且也成功用于实验数据处理[1,2]。

但是对于曲线的计算机拟合处理报道较少,且多用镜面法绘制曲线切线,求切线时随意性很大,即使对同一组实验数据的处理,同一操作者在不同时间进行处理,都得不到相同的结果,在物理量的计算中引入了较大误差。

O rigin软件具有强大的线性回归和曲线拟合功能,其中最具有代表性的是线性回归和非线性最小平方拟合,提供了200多个曲线拟合的数学表达式,能满足科技工作中的曲线拟合要求。

此外,O rigin软件还能方便地实现用户自定义拟合函数,以满足特殊要求,在物化实验数据处理过程中能简化数据处理难度[3]。

本文以沉降分析实验为例,详细介绍应用O rigin软件对物理化学实验数据进行非线性拟合的方法。

1　沉降曲线的拟合 以在13℃条件下,用单臂扭力天平对碳酸钙粉末作沉降分析实验,根据实验结果,在O rigin中绘制G(t)2t图(见图1)。

接着在 Analysis 菜单中选 Fit Linear ,Origin 将自 动对数据进行线性回归 ,画出回归后的直线 ,并在 Result 窗口中显示出回归方程的各项数据 ,如图 3 显示了数据表 、回归图和回归结果窗口 。
图 3 用 Origin 进行线性回归处理
从回归结果可以看到直线的斜率为 16. 954 ,由 此再根据方程 (1) 就可以得出常数 k 。
34
化学教学 2003 年 ,第 6 期
图表内以便于比较 。如绘制三个不同样品在同样实 验条件下的实验数据图 (如图 4) 。
首先在数据表内输入样品 A 的实验数据 ,输入 完成后 ,在 File 菜单中选择 New 再选择 New Work2 Sheet 。在新的数据表内输入样品 B 的实验数据 ,同样 将样品 C 的实验数据也输入到另一个新的数据表。
化 、加强管理 学生 2 、颗粒污染物除尘 活动 3 、SO2 、NOx、CO 等污染物处理 ,
SO2 :氨法 、钠碱法 、钙碱法处理 ,
培养学生积 极寻找解决 问题的方法
NOx :吸收法 、吸附法 、催化还原法 ,
CO :一次净化法 、二次净化法 、三元催化法 ……。
注 :教师要积极引导学生参于讨论大胆发表个人见解 。
为了更好的区别三条曲线及其数据点 ,可以改 变数据点颜色和样式 。在某数据线上双击 ,在出现 的“Plot Details”对话框中的 Symbol 页中可以设置该 组数据点的样式 、大小 、颜色等属性 。
图 4 用 Origin 将多组实验数据绘制在同一图内
4 三维图形的绘制 在一个电化学实验中 ,某电极在不同的极化电
然后选择样品 A 的数据表 , 在 Plot 菜单下选 Scatter ,就可以得到样品 A 的散点图 。为了在图上

基本的二维图形
线图 点图 点线图 多条曲线 其它二维图形
绘图的方法
1. 数据表窗口激活时绘图的方法 2. 图形窗口激活时绘图的方法 3. 在同一张图上绘制多条线 4. 绘制双Y轴图形
数据表窗口激活时绘图的方法
选定列或数据范围 select Plot: Graph
自动画出图形
方法2：在单坐标图上通过加层（Layer） 的方法添加横坐标和（或）纵坐标。
在单坐标图上加层的方法：选择Edit: New Layer
绘制函数图形
Graph – Add Function Graph
图形的编辑和格式化
1. 坐标轴的格式化 2. 坐标说明文本的格式化 3. 数据点和线的格式化 4. 添加文本框
坐标的格式化：通过以下方法之一打开坐标格式化 对话框
1. 双击坐标轴 2. 右击坐标轴→快捷菜单中选相应命令
3. 选Format菜单中的相应命令
坐标格式化对话框
坐标说明文本的格式化： 用下述方法之一打开文本控制对话框
1. 双击坐标说明文本 2. 右击坐标说明文本→快捷菜单中选相应命令
3. 选Format菜单中的相应命令
行的插入和删除
插入行 select Edit: Insert right-click and select Insert
删除行 Edit: Delete right-click and select Delete.
删除工作表
在这工作表右上方的关闭窗口按扭 在工程管理器中右击工作表图标，在快捷
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基于ThT荧光寿命检测蛋清溶菌酶蛋白寡聚体李成;王际辉;宋吉雪;刘婷婷;李妍;刘冰南;王亮;肖珊;李琳;耿旭辉【摘要】采用时间分辨荧光技术,检测了不同形态蛋白聚集体的荧光染料硫磺素T(ThT)荧光寿命.利用蛋清溶菌酶体外制备了蛋白聚集体;采用透射电子显微镜(TEM)及ThT稳态荧光检测了结合蛋白纤维生长的动力学曲线,确定其形成寡聚体及纤维样聚集体的特征和时间.通过时间相关单光子计数(TCSPC)技术测定了蛋清溶菌酶单体、寡聚体和淀粉样纤维的ThT荧光寿命曲线,并拟合、计算其荧光寿命.根据圆二色谱(CD)分析结果推测聚集体的结构不同导致其与ThT的结合状态不同,从而影响ThT荧光寿命.结果表明,通过测定ThT荧光寿命可以区分蛋白单体、寡聚体和纤维样聚集体,并监测蛋白寡聚体的形成,为后续病理蛋白聚集过程中形成寡聚体物质的监测提供了研究基础.【期刊名称】《高等学校化学学报》【年(卷),期】2019(040)001【总页数】6页(P90-95)【关键词】寡聚体;硫磺素T;时间相关单光子计数;荧光寿命【作者】李成;王际辉;宋吉雪;刘婷婷;李妍;刘冰南;王亮;肖珊;李琳;耿旭辉【作者单位】大连工业大学生物工程学院, 大连116034;大连工业大学生物工程学院, 大连116034;东莞理工学院化学工程与能源技术学院, 东莞523808;大连工业大学生物工程学院, 大连116034;大连工业大学生物工程学院, 大连116034;大连工业大学生物工程学院, 大连116034;大连工业大学生物工程学院, 大连116034;大连工业大学生物工程学院, 大连116034;大连工业大学生物工程学院, 大连116034;东莞理工学院化学工程与能源技术学院, 东莞523808;中国科学院分离分析化学重点实验室,大连116023【正文语种】中文【中图分类】O629.73许多神经退行性疾病(NDs), 如帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)等, 均与神经细胞内病理蛋白质的淀粉样纤维化(Fibril)密切相关[1,2]. 淀粉样纤维是指发生错误折叠的蛋白质形成的一类由β折叠片构成的丝状蛋白聚集体[3,4]. 机体内淀粉样纤维形成的斑块沉积长期被认为是导致一系列神经退行性疾病的根本原因[3]. 然而, 研究发现, 当将鸡溶菌酶蛋白的寡聚体注射到小鼠脑内时, 小鼠会出现神经退行性疾病的表症; 而注射了成熟的纤维后, 小鼠几乎无相关的损害和毒性[5]. 因此可认为, 蛋白质错误折叠时, 在聚集进程的前期形成的可溶性蛋白质“寡聚体”物质是导致神经退行性疾病发生的根本原因. 寡聚体通常是指由几个到几十个蛋白质单体形成的聚集体物质, 是淀粉样纤维聚集体的核体物质.对于寡聚体的检测, 多集中于特异性抗体物质的制备或酶联免疫吸附测定(ELISA)等[6]. 但这些检测手段对操作人员的技术及操作平台要求很高, 难以大范围推广和应用. 因此, 探索及时检测蛋白质错误折叠的寡聚体的常规技术, 对深入了解神经退行性疾病的病理机制非常重要, 对相关疾病的早期诊断也具有重要价值.荧光物质的荧光寿命与自身的结构、所处微环境的极性及黏度等条件有关, 因此利用荧光寿命可以直接了解研究如超分子体系中分子间的簇集、蛋白质高级结构等的体系变化. 目前, 常用荧光染料硫磺素T(ThT)的稳态荧光光谱检测、鉴定蛋白质在体外形成的纤维聚集体以及原位、组织学标本中的纤维[7]. ThT在不同溶液中的荧光寿命具有明显的差异[8]. 因此, 可利用时间分辨荧光技术检测不同形态蛋白聚集体的ThT荧光寿命, 以区分蛋白单体、寡聚体和纤维样聚集体, 并监测蛋白在聚集过程中形成的寡聚体物质.淀粉样纤维化是许多疾病病变蛋白的共性. 溶菌酶也是具有淀粉样纤维倾向的蛋白质之一, 因此溶菌酶蛋白经常被作为体外蛋白质纤维化研究的模型[9]. 本文选择蛋清溶菌酶作为研究对象, 通过强变性体系制备了蛋清溶菌酶的纤维样聚集体. 利用透射电子显微镜(TEM)检测了蛋清溶菌酶在不同孵育时间形成聚集体的状态; 结合ThT稳态荧光蛋白聚集的生长情况, 确定了蛋清溶菌酶在实验条件下形成寡聚体和纤维的时间段; 利用时间分辨荧光测量技术, 对蛋清溶菌酶单体、寡聚体和淀粉样纤维的ThT荧光寿命进行了检测; 通过三阶公式, 计算得出与不同状态聚集体结合的ThT的荧光寿命. 结果表明, 不同状态聚集体的ThT荧光寿命具有明显差异. 进一步利用圆二色谱(CD)对不同蛋白聚集体的二级结构进行了检测, 推测ThT与寡聚体及纤维均可结合, 但由于其不同聚集体的结构不同, 导致ThT与聚集体结合的程度和方位不同, 因此不同状态聚集体的ThT荧光寿命明显不同. 此结果为后续病理蛋白聚集过程中寡聚体物质的监测提供了相关的研究基础.1 实验部分1.1 试剂与仪器蛋清溶菌酶(Lysozyme, egg white, Mw=14300)购于Amresco公司; 荧光染料硫磺素T(ThT)和醋酸双氧釉购于Sigma公司; 400目普通碳膜铜网购于中镜科仪公司; 叠氮化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠及Tris-盐酸缓冲液等均为分析纯, 购于索莱宝(北京)公司.UV-2550 Probe型紫外分光光度计(日本岛津公司); LS-55型荧光分光光度计(美国Perkin-Elmer公司); LifeSpec Ⅱ型荧光寿命光谱仪(英国Edinburgh Instruments公司); JEM-2100(UHR)型透射扫描电子显微镜(日本电子公司); Jasco MOS450型圆二色光谱仪(CD, 英国Applied Photophysics公司); EPL-405皮秒脉冲二极管激光器(英国Edinburgh Instruments 公司), 脉冲宽度 86 ps, 此波长下仪器响应函数434.0 ps; 实验用水均由Milli-Q系统制备.1.2 实验过程1.2.1 蛋清溶菌酶聚集体的制备以10 mmol/L盐酸(pH=2.0)为溶剂配制20mg/mL的蛋清溶菌酶溶液. 将蛋白样品置于65 ℃的水浴锅内孵育, 参照文献[9,10]方法制备蛋白聚集体. 制备过程中, 在蛋白液中加入质量分数为0.05%的叠氮化钠, 以防止微生物污染. 每隔一定时间取样, 并于4 ℃保存待测; 剩余样品继续孵育制备聚集体.1.2.2 透射电子显微镜(TEM)表征蛋清溶菌酶聚集体形态将适量待测蛋清溶菌酶聚集体样品稀释至0.5 mg/mL, 参照文献[11]方法, 利用透射电子显微镜, 以80 kV电压, 在放大8万倍的条件下, 观察蛋清溶菌酶蛋白在不同孵育时间时产生的聚集体的形态.1.2.3 蛋清溶菌酶聚集的ThT荧光光谱检测用20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)配制终浓度为2.5 mmol/L的ThT荧光染料的储备液, 用滤膜(0.22 μm)过滤除去菌体及杂质后, 于4 ℃避光保存, 待用. 取50 μL蛋清溶菌酶聚集体待测样品, 加入2.9 mL Tris-HCl缓冲液(10 mmol/L, pH=8.0)和30 μL ThT母液, 然后涡旋振荡30 s, 避光静置30 min. 首先, 采用荧光分光光度计检测与蛋白聚集体结合的ThT 的荧光光谱, 确定其最大激发与发射波长; 进而检测不同蛋白聚集体的ThT荧光发射情况[12,13]. 实验中设置激发波长为440 nm(狭缝为10 nm), 发射波长为484 nm(狭缝为5 nm).1.2.4 聚集体ThT荧光寿命的时间分辨荧光技术检测采用具有时间相关单光子计数(TCSPC)技术的LifeSpec Ⅱ型荧光光谱仪测定了蛋清溶菌酶单体、寡聚体和淀粉样纤维聚集体的荧光寿命[14,15]. 设定激发波长为405 nm, 工作重复频率10 MHz. 通过F900数据采集处理软件(Edinburg Instruments Ltd.)采集数据. 对荧光寿命数据采用Origin9.0软件利用二阶指数方程进行拟合, 并最终求得ThT荧光寿命的均值.1.2.5 蛋清溶菌酶聚集体二级结构的圆二色光谱(CD)分析将孵育不同时间的蛋清溶菌酶聚集体样品用Tris-HCl缓冲液稀释, 使其终浓度为0.1 mg/mL. 将样品加入CD谱的比色皿中(宽度为1 mm), 在室温及190～260 nm波长下扫描蛋白溶液的CD谱[16].2 结果与讨论2.1 蛋清溶菌酶聚集的TEM表征利用TEM观察了蛋清溶菌酶孵育不同时间时产生的聚集体的形态. 溶菌酶蛋白在变性去折叠的条件(如强酸、高温及还原环境等)下, 能够形成淀粉样纤维化聚集体. 在pH=2.0, 65 ℃水浴条件下, 制备了蛋清溶菌酶的聚集体, 选取不同孵育时间的样品, 检测了蛋白的聚集情况.由图1可见, 与未经处理的空白对照组相比, 实验条件下孵育1 d时, 蛋清溶菌酶出现了较为规则的球状蛋白聚集体, 平均直径为18～80 nm. 每个蛋清溶菌酶蛋白单体的直径约为4.5 nm, 由此推算, 每个颗粒状聚集体由4～18个蛋白单体构成, 其相对分子质量为58000～260000[图1(B)]. 孵育2 d时, 聚集体的体积增大, 形态由初期的球形变成了不规则的聚集体, 并初步具有类线性形态的聚集体[图1(C)]. 孵育4 d时, 聚集体逐渐增大, 出现了部分类纤维的聚集结构[图1(D)]. 孵育6 d时, 蛋白寡聚体基本消失, 出现了短小的典型纤维丝结构, 其直径为8～15 nm, 纤维丝长度为0.3～1.5 nm[图1(E)]. 孵育9 d时, 蛋清溶菌酶蛋白已经形成了较长的纤维丝[图1(F)]. 由于蛋白分子之间结合尚不紧密, 所以此时纤维丝粗细不均, 结构较松散, 中空形态不够立体化. 随着孵育时间的继续延长(12～20 d), 纤维聚集体的结构逐渐至成熟状态, 其形态规则、均一、细长且无分支[图1(G)～(I)].Fig.1 TEM images of egg lysozyme aggregations at different incubationtime(A) The egg lysozyme without any treatment; (B—I) the aggregation samples for egg lysozyme at different time points(1, 2, 4, 6, 9, 12, 16 and 20 d), respectively.上述结果表明, 蛋清溶菌酶在实验条件下会形成典型的淀粉样纤维聚集体. 在聚集过程中, 蛋白由最初的寡聚体形成核体, 逐渐聚集延伸后, 形成纤维样的聚集体. 2.2 与纤维结合的ThT的吸收及发射光谱分析Fig.2 Chemical structure of thioflavin-T Arrows showing rotational movement around the central carbon bond.目前, 常用ThT检测蛋白的纤维聚集体. ThT作为分子转子[17,18], 当稀溶液中游离的ThT分子被激发时, 由于中央碳键的旋转作用, 其处于激发态的分子可以通过非辐射通道快速地弛豫回基态(见图2), 因此不会发出荧光. 但是, ThT能与淀粉样纤维侧链之间的“沟渠”位置结合, 由于结合部位的几何约束, 限制了其中央碳键的快速旋转, 导致其通过C—C单键旋转的非辐射态回归过程被抑制, 只能通过辐射荧光回到基态. 因此, ThT与淀粉样纤维结合后, 会被激发产生明显的发射荧光. 根据TEM表征结果, 测定了蛋清溶菌酶纤维样聚集体(孵育第16 d的样品)的发射光谱. 结果显示, 在440 nm波长的激发下, 与蛋白纤维聚集体结合的ThT在480 nm 处出现最大发射峰. 因此, 在后续的荧光实验中选取440 nm波长激发, 均以480 nm波长发射的条件检测蛋白聚集体的ThT的荧光情况.2.3 蛋清溶菌酶蛋白聚集体的ThT稳态荧光光谱分析ThT的稳态荧光光谱常用来表征蛋白淀粉样聚集体的产生[12,13,19]. 图3(A)和(B)分别展示了不同蛋清溶菌酶聚集体的ThT稳态荧光光谱及其纤维生长的动力学曲线. 结果表明, 在孵育0～2 d时, 在480 nm处ThT无发射峰, 尽管此时蛋白已经形成了寡聚体[图1(C)]. 孵育第4 d的样品在480 nm处出现明显的ThT荧光峰. 随着孵育时间的延长, 蛋白聚集体ThT的荧光强度逐渐增强. 孵育第9 d时, ThT荧光达到并稳定在较高的水平(9～20 d), 此时, 蛋清溶菌酶蛋白聚集体为成熟的淀粉样聚集体[图1(F)～(I)]. 上述结果表明, 利用ThT的稳态荧光可以监测蛋白的淀粉样纤维聚集体, 但不能监测蛋白在聚集前期形成的寡聚体.Fig.3 Steady state fluorescence emission(A) and the kinetic curve of aggregation(B) for the hen lysozyme samples in the experimental condition2.4 蛋清溶菌酶蛋白聚集体形成的ThT荧光寿命检测Fig.4 Fluorescence emission decay curves of ThT incubation with the samples of the egg lysozyme Incubation time/d: a. 0; b. 2; c. 16.ThT的荧光寿命与其结构、所处微环境的极性及黏度等条件有关. 因此, 通过荧光寿命可以直接了解物质体系周围环境发生的微观变化[20]. 利用时间分辨荧光技术检测了蛋清溶菌酶不同形态聚集体的ThT荧光寿命. 利用高重复频率的皮秒脉冲激光器激发(激发波长405 nm), 同时选取发射谱中强度最大处作为荧光衰减过程的检测波长. 此类荧光物质的荧光衰减过程往往呈现出多指数方程的衰减特性, 图4展示了蛋清溶菌酶蛋白单体(孵育0 d)、寡聚体(孵育2 d)和纤维聚集体(孵育16 d)的荧光寿命动力学曲线.利用二阶指数方程对不同孵育时间的蛋白聚集体的荧光寿命进行拟合[21], 计算得出相应样品的ThT荧光寿命(见表1). 结果表明, 单体蛋白的荧光寿命时间很短(τ=0.5 ns). 荧光光谱结果表明, ThT不能与单体蛋白结合, 被激发后也不会产生发射荧光, 因此单体蛋白样品内的ThT无荧光寿命(图4谱线a). 孵育2 d时蛋白寡聚体的ThT具有明显的荧光寿命(图4谱线b), 其寿命为1.06 ns, 约为蛋白单体ThT 寿命的2.0倍. 这表明虽然利用荧光光谱技术无法检测蛋白寡聚体, 但利用ThT的荧光寿命可以检测到寡聚体的形成, 从而区分蛋白单体与寡聚体. 纤维样蛋白聚集体的荧光寿命也明显长于寡聚体(图4谱线c), 计算其ThT的荧光寿命约1.50～1.60 ns, 约为寡聚体寿命的1.5倍. 上述结果表明, 利用时间分辨荧光技术检测ThT 的荧光寿命可以区分蛋白单体、寡聚体及纤维样聚集体.Table 1 Kinetic analysis of emission decay for ThT in the presence of egg lysozyme aggregationsamples for different incubationtime*Samplet/da1τ1/nsa2τ2/ns〈τ〉/nsMonomer06553.790.222060.400.760.50Oligomer11405.850.418060.291. 131.0925130.400.995134.201.131.06Fibril47893.800.961699.002.621.57876 56.820.922111.022.421.55127864.631.021735.952.731.66168323.951.00128 9.172.881.58* The value of fluorescence lifetime τ was calculated by the double-exponential fits, Y(τ)=a1eτ/τ1+a2eτ/τ2, which generates two lifetime values(τ1 and τ2), and the corresponding amplitudes(a1 and a2). The intensity-average lifetime 〈τ〉, using the following expression: was then determined.2.5 蛋清溶菌酶聚集体结构的CD谱分析Fig.5 CD spectra of the egg lysozyme aggregation Incubation time/d: a. 0;b. 2;c. 16.不同状态蛋白聚集体的ThT荧光寿命不同, 可能是由于蛋白寡聚体和纤维聚集体的二级结构不同, 从而导致其与ThT的结合状态不同. CD技术常用于检测蛋白大分子的二级结构[16,22]. 由图5可知, 天然溶菌酶在210～215 nm处有最低椭圆率, 在196 nm正峰处具有最高椭圆率, 表明溶菌酶的天然结构主要以α螺旋为主. 对于孵育2 d的寡聚体样品, 负峰位置红移至215 nm, 表明溶菌酶淀粉样纤维的构象正在由主要的螺旋转变为β折叠. 孵育16 d的蛋白聚集体, 负峰的位置主要处于216 nm, 即蛋白的纤维样聚集体以β折叠为主. CD谱结果说明, 3种状态蛋白的二级结构明显不同, 导致其与ThT结合的位置及其结合部位的局部物理化学环境不同, 进而对ThT分子的中心自旋旋转影响不同, 造成蛋白单体、寡聚体以及纤维的ThT荧光衰变的寿命不同.3 结论利用时间分辨荧光技术检测了不同状态蛋白聚集体的ThT荧光寿命. 结果表明, 基于ThT的荧光寿命可区分具有不同聚集状态的寡聚体、淀粉样纤维和单体, 从而监测蛋白寡聚体的形成. 本文结果为后续病理蛋白聚集过程中寡聚体物质的监测提供了相关的研究基础.参考文献【相关文献】[1] Landreh M., Sawaya M., Hipp M., Eisenberg D., Wüthrich K., Hartl F., Intern. Med., 2016, 280, 164—176[2] Pinney J. H., Hawkins P. N., Ann. Clin. Biochem., 2012, 49(3), 229—241[3] Stefani M., FEBS J., 2010, 277(22), 4602—4613[4] Song S. M., Ma X. W., Zhou Y. H., Xu M. T., Shuang S. M., Dong C., Chem. Res. Chinese Universities, 2016, 32(2), 172—177[5] Gharibyan A. L., Zamotin V., Yanamandra K., Moskaleva O. S., Margulis B. A., KostanyanI. A., Morozova-Roche L. A., Mol. Biol. J., 2007, 365, 1337—1349[6] Sarroukh R., Goormaghtigh E., Ruysschaert J. M., Raussens V., Biochim. Biophys. Acta, 2013, 1828, 2328—2338[7] Biancalana M., Makabe K., Koide A., Molecular S., Journal of Molecular Biology, 2009, 385(4), 1052—1063[8] Verma M., Vats A., Taneja V., Annals of the Indian Academy of Neurology, 2015, 18, 138—145[9] Akihito H., Hiroyuki A., Akio K., Biosci. Biotechol. Biochem., 2008, 72(6), 1523—1530[10] Frare E., Mossuto M. F., de Laureto P. P., Tolin S., Menzer L., Dumoulin M., Dobson C. M., Fontana A., Mol. Biol. J., 2009, 387, 17—27[11] Orte A., Birkett N. R., Clarke R. W., Devlin G. L., Dobson C. M., Klenerman D., Proc. Natl.Acad Sci. USA, 2008, 105, 14424—14429[12] Landau M., Sawaya M. R., Faull K. F., Laganowsky A., Jiang L., Sievers S. A., Liu J., Barrio J. R., Eisenberg D., PLoS Biol., 2011, 9(6), e1001080[13] Song S., Wang Y., Xiong L., Qu L., Xu M., Chem. Res. Chinese Universities, 2013, 29(1), 20—25[14] David J. L., Moa S. W., Melina G. G., Fredrik W., Elin K. E., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2015, 458, 418—423[15] Hanczyc P., Sznitko L., Zhong C., Heeger A., ACS Photonics. J., 2015, 2, 1755—1762[16] Dumoulin M., Kumita J. R., Dobson C. M., Acc. Chem. Res., 2006, 39, 603—610[17] Biancalana M., Koide S., Biochim. Biophys. Acta, 2010, 1804, 1405—1412[18] Amdursky N., Erez Y., Huppert D., Acc. Chem. Res., 2012, 45(9), 1548—1557[19] Singh P. K., Mora A. K., Nath S., Chem. Commun., 2015, 51, 14042—14045[20] Xue W. F., Hellewell A. L., Gosal W. S., Biol. Chem. J., 2009, 284, 34272—34282[21] Chen Y. C., Pu Y. C., Hsu Y. J., J. Phys. Chem. C, 2012, 116, 2967—2975[22] Sznitko L., Hanczyc P., Mysliwiec J., Samoc M., Appl. Phys. Lett., 2015, 106, 023702。

荧光寿命测定的现代 方法与应用
七彩的荧光
主要内容
• 荧光及荧光分光光度计的发展 • 荧光寿命的基本原理 • 荧光寿命测定的现代方法及数据处理 • 测定荧光寿命的一些应用 • 测定荧光寿命的仪器
The Development of Fluorescence Microscopes
The first fluorescence microscopes were developed between 1911 and 1913 by German physicists Otto Heimstt and Heinrich Lehmann as a spin-off from the ultraviolet instrument.
时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-Photon
Counting , TCSPC)
实际测定中,必须调节样品的荧光强度,确保每次激 发后最多只有一个荧光光子到达终止光电倍增管。否 则会引起“堆积”效应(Pileup Effect)。
“堆积”效应是指荧光衰减曲线向短寿命一方偏移 的现象。
(b) 检测时间门与荧光衰 减关系示意图
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
频闪技术(Strobe Techniques)
频闪技术(Strobe Techniques)的优缺点： 新一代频闪分时光谱仪有着TCSPC 的准确性，比
相调制测定速度更快，操作也很方便，仪器价格也大 大降低。不过脉冲法得到的荧光衰减曲线包含噪音的 水平尚无法知道，在数据分析时应当有所估计。
频闪技术(Strobe Techniques)
频闪技术也叫脉冲取样技术( Pulse Sam-pling Techniques) ，1987 年PTI 公司将纳秒级频率荧光寿命测定仪商品化。最近 PTI 公司推出了新一代频闪分时光谱仪。脉冲取样法测定荧光寿 命工作原理如下图所示。

31
• 荧光寿命单指函数，双指函数，三指函数拟 合有什么区别
• I(t) = I0exp(- t/τ) • I(t)=I0+A1exp(-t/τ1)+A2exp(-t/τ2) • τ=(A1τ12+A2τ22)/(A1τ1+A2τ2)
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• ①经验公式是多项式。 ②所以在一般场合下，这种拟合模型统称为 线性的。 ③最小二乘法下，得到【关于待定参数的方 程组都是线性的】。 相异点（都是【非本质】的）
异.
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例子（5）浓度增加，寿命减小
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• 在 347 nm 激发、监测 575 nm 的条件下，测量 Ba3La1-x( PO4)3:xDy3+系列样品的的衰减曲线，如 图 5 所示。衰减曲线与单指数函数I =I0exp(-t /τ) 符合得很好，I0是t = 0 时的荧光强度，τ是荧光寿 命。x =0.04，0.08，0.10，0.15对应的荧光寿命 分别为 0.881，0.804，0.733，0.680 ms。随着 Dy3 +掺杂浓度的增加，荧光寿命逐渐减小。
1
寿命是衰减常数k的倒数。事实上，在瞬间激发后的某个 时间，荧光强度达到最大值，然后荧光强度将按指数规律
下降。从最大荧光强度值后任一强度值下降到其1/e所需
的时间都应等于。
2
如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量， 则荧光寿命与荧光发射速率的衰减常数成反比，荧光发 射速率即为单位时间中发射的光子数，因此有F 1/KF 。KF是发射速率衰减常数。
子吸收能量后从基态跃迁到某一激发态上，再以
辐射跃迁的形式发出荧光回到基态。当去掉激发
光后，分子的荧光强度降到激发时的荧光最大强
度I0的1/e所需要的时间，称为荧光寿命，常用表 示。如荧光强度的衰减符合指数衰减的规律:

激光诱导植物叶绿素荧光寿命及光谱特性分析万文博;苏俊宏【期刊名称】《光子学报》【年(卷),期】2018(47)6【摘要】传统荧光光谱分析法虽能用于评估植物生理状况,但在植物遥感探测中该方法具有抗干扰性弱、待测数据量大的缺陷.针对此问题,提出一种荧光寿命成像技术,将植物荧光寿命及光谱信息结合,分析植物内在生理信息,实现了远距离、大范围精确测量植物生理状况.采用时间分辨测量法,用连续激光脉冲照射植物产生大量相同的荧光信号,同时不断改变探测器的启动延迟时间,得到完整的荧光信号,用解卷积法反演植物荧光寿命.对活体法国冬青植株的光谱信息与荧光寿命特性进行了研究,结果显示植物荧光寿命与叶绿素含量成线性关系,并且植物叶绿素含量在0.03~0.06 mg/cm^2这一特定范围,线性相关系数高达0.9051,比荧光光谱能更精确地反映植物叶绿素含量.【总页数】6页(P152-157)【关键词】光谱学;激光诱导荧光;时间分辨测量法;荧光寿命成像;荧光光谱;荧光激光雷达【作者】万文博;苏俊宏【作者单位】西安工业大学光电工程学院【正文语种】中文【中图分类】O657.3;TP391.4【相关文献】1.稀土配合物的时间分辨荧光光谱法研究(Ⅱ)——Eu，Sm-DBM-TOPO体系的荧光衰减动力学特性和激光诱导时间分辨荧光光谱 [J], 胡继明;陈观铨;曾云鹗2.激光诱导植物荧光寿命校正技术及其特性分析 [J], 万文博;苏俊宏3.基于激光诱导叶绿素荧光寿命成像技术的植物荧光特性研究∗ [J], 万文博;华灯鑫;乐静;闫哲;周春艳4.激光诱导叶绿素荧光寿命的测量及其特性分析 [J], 万文博;华灯鑫;乐静;刘美霞;曹宁5.基于激光诱导荧光光谱分析的黄瓜叶片叶绿素含量检测 [J], 杨昊谕;于海业;张蕾;隋媛媛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。