SMART RACE技术

5 Race(2007-11-18 21:37:08)转载▼分类：核酸技术如果您顺的话，一个礼拜足矣！同意，5'-RACE确实比较难，但也有顺利的时候，我上周做5'-RACE也一次就成功了，我觉得关键还是RNA 的质量，如果RNA模板质量不好，后面做得再认真也是白费！当时要克隆基因的5'GC含量达到了80%，一般的反转录酶和PCR都拿不到，后来加了海藻糖60度反转录一个小时后，用TaKaRa的GC-Buffer和LA-Taq才扩出来，当时就为了这个5端，很是费了力气。

如果RCR产物不是很特异或没有目的条带的话，建议用nest PCR。

在做5‘时，对RNA要求比较高，最好用新鲜的组织提，随即做逆转录，扩增。

做RACE PCR条带单一的不多，尽可能的回收与目的片段大小相近的条带。

克隆的时候，一般kit上建议挑8-10个克隆，多一个，多一份希望，因为RACE，尤其是5’太难了，我作了约6个月。

偶没有买试剂盒，自己合成了3条引物，买了反转录酶。

然后一次就出来了。

RACE的盒子最常用的是CLONTECH和INVITROGEN的，这个方法我也试过很多次了，方法很简单，但是作出来效果非常的不理想。

PCR出来的东西都是杂七杂八的东西，更多的时候是弥散的条带。

SmartRace 既然称之为Smart，因为它的引物能特异的识别5'端帽子位点，因此排除了所有非完全的逆转录。

再加上使用基因特异性引物，使其做出来的可能性更大。

这个方法省钱，但是我不是很看好，祝好运。

另，建议你不要用oligodT进行逆转录，在基因mRNA300bp处设计一条或几条基因特异性逆转录引物更好。

希望你能有好结果。

我刚做过5’、3‘ RACE，我个人的经验如下：1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区；3、用巢氏PCR相对容易出结果；4、如果出现多个条带，要分别验证；5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min；6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。

【共享】全长cDNA文库的构建—SMART技术全长cDNA文库的构建—SMART技术真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA 的末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。

但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。

常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。

但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。

另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。

SMART技术的出现是一个新的里程碑。

这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA 单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。

5’-RACE技术的意义：可以精确定位转录起始位点。

但是定位转录起始位点又有什么意义呢？以RNA聚合酶Ⅱ为例，启动子区一般位于转录起始位点上游200-300bp的范围内，也即转录起始位点的确定有助于分析基因的转录。

而且有些基因具有多个转录起始位点，通过5’-RACE技术可以精确定位之，进而详细研究基因的调控机制。

5’-RACE试剂盒一般基于以下几种技术：SMART、Oligo capping method、self-ligation和anchored PCR。

下面将分别介绍这些技术的原理和各自的优缺点。

1、SMART技术。

该技术是基于以下两个观察发展起来的：a、不同反转录酶包括MMLV合成的cDNA 3’端保真度不高；b、不同的反转录酶具有不同的加尾特性，MMLV特意的在cDNA末端加上3-4个dCTP。

该技术用MMLV合成cDNA 第一链，同时利用它的加尾特性在合成的cDNA链3’加上3-4个dCTP，而且当帽子结构存在时该酶的加尾活性最高（对全长分子的富集机制），随后这3-4个碱基与体系中事先加入的引物（该引物的3’端有3-4个dGTP）配对，MMLV继而以聚合酶活性将配对引物补成双链。

目前基于该技术的试剂盒只有Clontech 公司生产，全名为SMART RACE cDNA amplification kit（Cat634914）流程见图：该方法的突出优点就是操作简便，成功率较高，全场分子的比例较高。

cDNA第一链的合成和加尾一步即完成，避免了其他方法中对mRNA和cDNA链的反复操作，降低了mRNA降解和合成产物丢失的风险，使本来就含量甚微的全长分子得到最大保存，所以这种方法得到了广泛认可，应用最多。

如果加上RNA提取时间，这种技术可以在3个小时内得到加上接头的cDNA产物，最大限度地降低了mRNA的降解风险。

2、Oligo capping method方法（又称RLM-RACE）是由日本东京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。

BD SMART™ RACE cDNA Amplificatin Kit User ManualTable f CntentsI. 简要概述II. 成分列表Cntrl Human PlacentalTtal RNA 和BD SMART II A lignucletide在–70°C下保存。

NucleTrap Gel Extractin Kit 室温下保存。

其余试剂–20°C下保存。

随BD SMART RACE cDNA Amplificatin Kit 同时免费提供BD PwerScript Reverse Transcriptase和BD Advantage 2 PCR Kit。

所有试剂可以满足7 次cDNA 合成反应和30次PCR反应。

First-strand cDNA 合成•7µl BD SMART II™ A lignucletide (12 µM)5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'• 7µl 3'-RACE CDS Primer A (3'-CDS; 12 µM)5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N–3'(N = A, C, G, r T; V = A, G, r C)• 7µl5'-RACE CDS Primer (5'-CDS; 12 µM)5'–(T)25V N–3' (N = A, C, G, r T; V = A, G, r C)• 7µl BD PwerScript™ Reverse Transcriptase• 200 µl 5X First-Strand Buffer250 mM Tris-HCl (pH 8.3)375 mM KCl30 mM MgCl2• 200 µl Dithithreitl (DTT; 20 mM)• 1ml Deinized H25'- & 3'-RACE PCR• 400 µl 10X Universal Primer A Mix (UPM)Lng (0.4 µM):5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3' Shrt (2 µM):5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'• 50 µl Nested Universal Primer A (NUP; 10 µM)5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'Cntrl Reagents• 5µl Cntrl Human Placental Ttal RNA (1 µg/µl)• 25 µl Cntrl 5'-RACE TFR Primer (10 µM)• 25 µl Cntrl 3'-RACE TFR Primer (10 µM)General Reagents• 70 µl dNTP Mix (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, each at 10 mM)• 2 X 1 ml Tricine-EDTA Buffer10 mM Tricine-KH (pH 8.5)1.0 mM EDTANucle Trap® Gel Extractin Kit (Cat. N. 636053 r K3070-y)• 100 µl NucleTrap Suspensin• 3 ml NT1 Buffer• 10 ml NT2 Buffer• 2ml NT3 Buffer• User Manual (PT3169-1)Free trial-size BD Advantage™ 2 PCR Kit (Cat. N. 639207 r K1910-y)The BD Advantage 2 kit prvides sufficient reagents fr 30 PCR reactins.The fllwing cmpnents are included:• 30 µl50X BD Advantage 2 Plymerase Mix• 200 µl10X BD Advantage 2 PCR Buffer• 50 µl 50X dNTP Mix (10 mM each)• 30 µl Cntrl DNA Template (100 ng/µl)• 30 µl Cntrl Primer Mix (10 µM each)• 1 ml PCR-Grade Water• User Manual (PT3281-1)III. 另备物品下列试剂需另外准备：• 0.5-ml PCR 反应管，推荐使用PerkinElmer GeneAmp 0.5-ml reactin tubes (Cat. N. N801-0737 r N801-0180).• Mineral il (e.g., Sigma Cat. N. M-3516)IV. BD SMART RACE的要点使用前请全面阅读•所有参数均经过优化，但可能因所使用的酶、模版、引物和热循环仪而不同。

利用 RACE 技术获得甜菜 M14 品系特异表达基因 M14-86 的 5′末端陈速黑龙江大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨（150080）E-mail：chensu208@摘 要：本文利用 RACE 技术对从 M14 品系花期特异表达基因 cDNA 文库中筛选获得的 cDNA Me-c86（Me-c86 所在基因命名为 M14-86）进行 5′-RACE 扩增，并将所获得的 5′末 端 cDNA 与其 3′端 cDNA 序列进行拼接，获得的基因 M14-86 的 cDNA 全长为 1 330bp。

将 M14-86 全长 cDNA 序列提交到 GenBank 数据库进行 BLASTn 分析，结果表明， 该基因与大 花马齿苋（Portulaca grandiflora）等植物的 26S rRNA 基因序列相似性高达 97%，该基因全 长 cDNA 序列的获得，为进一步研究甜菜 M14 品系特异表达基因生物学特性提供了有用的 信息。

关键词：甜菜 M14 品系； M14-86；5′-RACE；BLAST 中图分类号：Q 71. 引言自 1998 年开始，郭德栋教授等以二倍体栽培甜菜（B.vulgaris L.）与四倍体野生种白花 甜菜（B.corolliflora Zoss.）进行种间杂交，获得了真实杂种 F1 VC88-1（VVCC，2n=36） ， 然后通过与栽培甜菜回交，首次合成了异源三倍体甜菜（VVC，2n=27） ；获得了带有白花 甜菜染色体的完整栽培甜菜单体附加系，共 9 种类型（VV+1C1-9，2n=19） ，其中带有白花 甜菜 9 号染色体的单体附加系 M14 品系（VV+1C9，2n=19）其传递率在 96.5％以上。

通过 专家鉴定，认为带有白花甜菜第 9 号染色体的栽培甜菜单体附加系 M14 品系是克隆无融合 生殖基因极其难得的材料[1-5]。

cDNA 末端快速扩增技术[6]（rapid amplification of cDNA ends, RACE） ，是一种从低丰度 转 录 本 中 快 速 扩 增 cDNA 5′ 和 3′ 末 端 简 单 而 有 效 的 方 法 ， 也 被 称 为 锚 定 PCR （Anchored-PCR）或单边 PCR （one- sided PCR） 。

CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介CDNA末端快速扩增技术(RACE)是一种利用PCR技术从低丰度的转录本中快速获取CDNA的5’和3’末端序列的方法。

这种方法的优点是简单、快速、廉价，可以用于研究基因的结构和表达。

RACE技术有两种主要类型，分别是3-RACE和5-RACE，分别用于扩增CDNA的3’和5’末端序列。

3-RACE原理和步骤3-RACE原理是利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用一个带有SMART序列的通用接头引物Oligo(dT) 30MN作为锁定引物，反转录合成第一链cDNA。

然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。

3-RACE步骤如下：•从RNA样品中提取mRNA，并用Oligo(dT) 30MN作为锁定引物进行反转录反应，合成第一链cDNA。

•用GSP1和UPM作为引物进行第一轮PCR反应，扩增出包含目的基因3’末端序列和接头序列的片段。

•从第一轮PCR产物中纯化出目标片段，并用UPM和另一个靠近GSP1的内嵌引物GSP2进行第二轮PCR反应，扩增出更精确的目标片段。

•从第二轮PCR产物中纯化出目标片段，并进行克隆、测序和分析。

5-RACE原理和步骤5-RACE原理是先利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用oligo (dT) 30MN作为锁定引物，在反转录酶MMLV作用下，反转录合成第一链cDNA。

利用该反转录酶具有的未端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3-5个(dC)残基，与含有SMART序列的Oligo (dG)通用接头引物配对后，继续延伸而连上通用接头。

然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物GSP2作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。