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免疫分析技术和相关仪器4.1．酶免疫分析仪4.1.1酶免疫分析技术的分类酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA) 是目前临床应用最多的一类免疫分析技术，可分为非均相(或异相)酶免疫测定和均相酶免疫测定两种方法。
均相酶免疫分析法（homogeneous enzyme immunoassay，HEI）均相酶免疫分析主要有酶扩大免疫测定技术和克隆酶供体免疫测定两种方法。
非均相酶免疫分析法（heterogeneous enzyme immunoassay）常用的酶免疫分析法多为非均相法，又可分为液相酶免疫法和固相酶免疫法两种，以后者最常用，称为酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。
ELISA是临床上最常用的免疫分析方法，目前常用的酶免疫分析仪都是基于ELISA技术，称为酶免疫分析仪。
4.1.2酶免疫分析仪的类型、工作原理及基本结构根据仪器结构和自动化程度, 针对固相支持物的不同（如微孔板、试管、小珠、磁微粒等）作为吸附免疫试剂的载体，因而设计成不同的酶免疫分析仪，其基本工作原理就是分光光度法，在光电比色计或分光光度计的基础上根据ELISA技术的特点而设计。
包括：微孔板固相酶免疫测定仪器国际上微孔板式ELISA使用的载体为96孔板，采用直接对微板孔测定吸光度（A）的比色计。
(1) 酶标仪酶标仪也称为ELISA测读仪（ELISA reader）,有单通道和多通道两种类型。
自动型多通道酶标仪有多个光束和多个光电检测器，检测速度快。
如8通道的仪器，设有8条光束（或8个光源）、8个检测器和8个放大器。
多通道酶标仪的检测速度较快。
酶标仪的工作原理与主要结构和光电比色计几乎完全相同（见图16-1）。
既可以使用和分光光度计相同的单色器，也可以使用干涉滤光片来获单色光，此时将滤光片置于微孔板的前、后的效果是一样的。
图16-1 酶标仪工作原理酶标仪的工作原理和光路与普通光电比色计的不同之处在于（见图16-2）：比色液的容器不是比色皿，而是用塑料微孔板；酶标仪以垂直光束通过微孔板中的待测液；酶标仪通常使用光密度OD来表示吸光度。
酶联免疫分析法生工121 徐娜酶联免疫分析法是目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，特别是在食品和饲料中有毒有害物质的检测应用极为广泛。
酶联免疫分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。
该技术的原理主要有三点：第一、抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍具有其免役活性；第二、抗体或抗原与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量。
酶联免疫法在医药、食品加工业、农牧渔业等领域有着广泛的应用：如乙型肝炎、莱姆病，急性心肌梗死的早期诊断，定量检测内毒素，HIV抗体初筛，SARS 病毒的快速检测；检测食品中的病毒，残留农药，微生物及其其它成分；检测香蕉有关病毒，小麦黄花叶病毒，检测水产品中氯霉素的残留量，禽脑脊髓抗体等。
一、医学临床中的应用医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提供了特异性、敏感性强的试验基础。
1、乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的抗原或抗体，一直受到各级医疗卫生机构检验科室的高度重视。
尤其是对乙型肝炎，甲型肝炎，丙型肝炎的血清学检测，更因为试剂盒的推出而得到广泛开展。
上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检测方法，绝大部分都是酶联免疫分析法。
2、简化莱姆病的诊断：由于在作出博氏疏螺旋体感染诊断前要进行双重测试，因此莱姆病的测试可能花费很长时间。
采用由关键的疏螺旋体抗原决定簇构成的重组蛋白开发出一种新的酶联免疫测定方法。
该测试比最常用的商业全细胞酶联免疫测定法特异，而敏感性相同，并且在20分钟就会产生结果。
3、急性心肌梗死的早期诊断：急性心肌梗死为一多发病，病情严重。
目前对此病的策略是尽早的确诊并迅速积极的治疗。
约有四分之一或更多的患者，在初诊时心电图并不显示典型心肌梗死心电图异常，无Q波。
酶联免疫法和化学发光法
酶联免疫法（ELISA）和化学发光法（CLIA）是两种常用的免疫分析技术，用于检测和定量生物分子，如蛋白质、抗体、激素等。
它们在实验室和临床诊断中广泛应用。
酶联免疫法是一种基于酶催化反应的免疫分析方法。
其基本原理是将待测物（抗原或抗体）与固相载体（如微孔板）上的抗体或抗原结合，然后加入酶标记的抗体或抗原，形成三明治复合物。
当加入底物时，酶会催化底物发生反应，产生可检测的信号，通常是颜色变化或荧光强度。
通过测量这些信号，可以定量待测物的浓度。
酶联免疫法具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，适用于大规模样本的检测。
它可以用于检测多种生物分子，如蛋白质、激素、药物、病原体等。
常见的酶联免疫法包括间接法、夹心法和竞争法等。
化学发光法是一种基于化学发光反应的免疫分析方法。
其基本原理是将待测物与固相载体上的抗体或抗原结合，然后加入标记有发光物质的抗体或抗原，形成三明治复合物。
当加入触发剂时，发光物质会被激发并产生光信号。
通过测量光信号的强度，可以定量待测物的浓度。
化学发光法具有灵敏度高、线性范围宽、快速等优点，适用于微量和痕量分析。
它可以用于检测多种生物分子，如蛋白质、激素、药物、病原体等。
常见的化学发光法包括间接法、夹心法和竞争法等。
总的来说，酶联免疫法和化学发光法都是常用的免疫分析技术，它们各有优缺点，适用于不同的应用场景。
选择哪种方法取决于待测物的特性、检测要求以及实验室的设备和技术水平。
酶联免疫吸附法标准
酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的免疫分析技术，用于检测和定量分析特定蛋白质或其它
分子的存在。
这种分析方法是基于抗原与抗体的高度特异性结合原理。
以下是酶联免疫吸附法的一般标准步骤：
1. 准备微孔板：将酶标板的孔洞涂覆有抗原或抗体，使其吸附
在微孔板上。
2. 样本处理：将待检样本经过必要的预处理，如稀释、清洗等。
3. 加入样本：将处理好的样本加入到微孔板中，使抗原或抗体
与样本中的目标物质结合。
4. 免洗步骤：根据实验需要，可能需要进行一些免洗步骤来清
除非特异性结合物质。
5. 加入检测抗体：加入检测抗体，用于与目标物质结合。
6. 再次免洗步骤：如有需要，进行免洗步骤来清除非特异性结
合物质。
7. 加入酶标记抗体：加入酶标记抗体，它与检测抗体结合形成
复合物。
8. 加入底物：加入底物，使酶作用并产生可测量的信号。
9. 反应停止：加入反应终止剂停止酶反应，停止信号产生。
10. 信号检测：使用酶标仪或其他测量设备测量底物反应产生的
信号强度。
11. 数据分析：根据标准曲线或其他定量方法，计算样品中目标
物质的浓度。
需要注意的是，ELISA的具体步骤可能会因实验目的、样品类型
等因素有所差异，以上所述仅为一般标准步骤。
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免疫层析和酶联免疫法的区别（大纲）一、引言1.1研究背景1.2研究意义二、免疫层析技术2.1基本原理2.2试剂与材料2.3操作步骤2.4优缺点分析三、酶联免疫法3.1基本原理3.2试剂与材料3.3操作步骤3.4优缺点分析四、免疫层析与酶联免疫法的区别4.1技术原理差异4.2检测速度与操作简便性4.3灵敏度与特异性4.4应用场景与领域五、免疫层析与酶联免疫法的应用实例5.1免疫层析法的应用5.1.1快速检测5.1.2野外诊断5.1.3疫情监控5.2酶联免疫法的应用5.2.1生物医药领域5.2.2疾病诊断与监测5.2.3食品安全检测六、发展趋势与展望6.1技术创新与改进6.2跨学科研究与应用6.3市场前景与政策支持七、总结7.1主要结论7.2研究局限7.3未来研究方向一、引言随着现代生物医学技术的飞速发展，快速、准确、低成本的生物检测方法在疾病诊断、健康监测以及生物安全等领域发挥着越来越重要的作用。
在众多的生物检测技术中，免疫层析和酶联免疫法作为两种广泛应用的方法，各自具有一定的优势和局限性。
因此，深入研究这两种技术的区别，对于我们更好地理解它们的工作原理、优化检测过程以及提升检测性能具有重要意义。
酶联免疫吸附测定法基本步骤酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生物化学分析技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在和浓度。
其基本步骤包括固相化免疫反应、酶标记物检测、底物显色和测定结果的分析。
一、固相化免疫反应固相化免疫反应是ELISA的第一步，通常使用微孔板作为固相载体。
首先，在微孔板的孔中添加特定抗原或抗体，使其与孔壁结合形成固相。
然后，将孔中的非特异性结合位点封闭，以防止后续步骤中的非特异性结合。
此步骤旨在固定待测物质，使其能够与特异性抗体发生免疫反应。
二、酶标记物检测酶标记物检测是ELISA的关键步骤之一。
在这一步骤中，将与待测物质特异性结合的酶标记物加入孔中，并与待测物质发生免疫反应。
酶标记物可以是酶抗体复合物，也可以是酶标记的抗原。
典型的酶标记物有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）。
该步骤的目的是通过酶标记物的存在来检测待测物质的存在和浓度。
三、底物显色底物显色是ELISA的关键步骤之一，用于检测酶标记物的存在。
在这一步骤中，将适当的底物加入孔中，与酶标记物发生化学反应。
底物的选择取决于酶标记物的类型，常见的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）和pNPP（对硝基苯磷酸盐）。
化学反应的产物可呈现颜色变化，例如TMB底物在酶的作用下会变成蓝色。
颜色的强度与酶标记物的浓度成正比，从而可以间接反映待测物质的存在和浓度。
四、测定结果的分析测定结果的分析是ELISA的最后一步，通过测量底物显色反应的光密度来定量分析待测物质的浓度。
通常使用酶标仪或分光光度计来测量吸光度，并将所得数据进行处理和分析。
根据标准曲线，可以将吸光度值转化为待测物质的浓度值。
ELISA的结果可以是定性的（阳性或阴性），也可以是定量的（浓度值）。
免疫分析法(immunoassay,IA)是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。
由于疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限,使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。
1、酶免疫分析(EIA)酶免疫分析是一种非放射性标记免疫分析技术,以酶标记抗原或抗体作为示踪物,由高活性的酶催化底物显色或发光,达到定量分析的目的。
这种方法是对细胞融合技术的一项重要应用。
因其操作简便,不需昂贵设备,不污染环境,加之酶标记物相当稳定,有效期长,应用范围广泛而受环境检验工作者青睐。
最初应用的EIA技术,多采用HRP标记抗体或抗原,灵敏度不高。
后来逐步发展了各种放大体系,如底物循环放大体系、酶联级放大体系、生物素-亲和素放大体系、脂质体或红细胞等作为标记物载体以包载大量标记物的放大体系,以及采用PCR技术的PCR-EIA分析,使灵敏度有很大改进。
1.1生物素-链亲和素酶免分析(biotin avidin system BAS-EIA)[1]生物素(botin)广泛存在于动植物组织中,在生物体内是羧化酶的辅酶;亲合素又名抗生物素蛋白,与生物素具有高度的亲和性,利用这一点,以生物素和亲和素为中介,可增强抗原-抗体反应的结合提高检测方法的灵敏度。
但亲和素的非特异性结合高,后又发现另一种亲合素,称之为链亲合素(Streptavin,SA),克服了亲合素非特异性结合高的缺点。
免疫分析技术中,目前均采用SA供标记酶或其它示踪剂。
一个完整的SA分子上的4个相同亚基,都可以和一个生物素分子结合,其Ka值达1015L/mo1,是抗体抗原反应的10~100万倍。
又加之一个抗体或抗原分子结合多个生物素分子,不改变其免疫活性。
1.2脂质体免疫分析法(liposome immunoassay,LIA)[1]脂质体是一种生物摸拟膜,它是磷脂分子分散于水相介质中形成的密闭的双子单层或多层的囊泡。
其膜内可包容上万个标记物分子,具有很高的信号放大作用。
因此,将脂质体用于免疫分析是提高非放射免疫分析灵敏度的有效途径之一,由此所建立起来的方法即为脂质体免疫分析法。
1.3PCR-EIA分析[1]PCR-EIA技术是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性,它以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体,用PCR扩增抗体所连接的DNA,由PCR产物的量来反映抗原分子的量。
由于PCR的高扩增能力,只需数百个抗原分子即可检测,甚至在理论上可检测到一至数个抗原分子。
1.4酶联免疫吸附测定法(ELISA)[2]ELISA是一种主要的免疫分析方法,又可分为直接竞争法、接竞争法、双抗体夹心法和间接夹心法。
直接竞争法是将抗体包被到聚苯乙烯微孔反应板上,加入酶标记农药和待测农药,酶标记农药和待测农药之间与抗体的竞争而发生结合反应。
由于待测农药多,则反应后被吸附到反应板上的酶标记农药少,即吸附到酶反应板上的酶标记农药的量与待测液中农药的含量成反比。
加入酶底物显色后,进行比色,可以测定待测农药含量。
间接竞争法的前一部分与抗原包被直接竞争法相同,只是不用酶标记农药抗体(一抗),而是标记第一抗体,在竞争反应结束后,加入酶标一抗,发生一抗与酶标一抗的结合反应,被结合的酶标一抗的量与包被抗原结合的一抗的量的变化趋势是一致的,即被结合的酶标一抗的量与待测农药的含量成反比。
此方法的优点是一个农药抗体可以结合多个酶标一抗,大大提高了方法的灵敏度。
双抗体夹心法是将抗体包被固相载体,加入待测抗原使其与过量的固相抗体结合,再加入过量的酶标记相同的抗体,分离固相和游离相的化合物,加入底物,据显色程度来求出样品中抗原的含量。
间接夹心法是将样品中的抗原结合于过量的固相抗体,加入过量的同种抗体(一抗),洗涤后加入酶标一抗,最后加入底物反应,据显色程度确定待测抗原的含量。
2、免疫分析技术在环境领域中的应用1960,Y alow和Berson年第一次应用免疫分析技术检测血清中的胰岛素。
随后,免疫分析技术迅速发展起来,但主要集中在生物化学、临床医学等领域。
直到20世纪80年代免疫分析技术对环境化学物质检测的应用才受到了重视。
1971年,Ercegovich首先提出了将免疫化学方法应用到环境领域。
他建议用免疫学的筛选方法快速检测农药残留。
1975年,杀虫剂、艾氏剂和狄氏剂的放射免疫分析作为免疫分析应用于环境污染物检测领域第一次报道出来。
在初始阶段,研究者将注意力集中在了农药的免疫学分析中,他们做了大量的工作,所用的技术主要是放射免疫法(RIA)。
1972年,V anweemen和Engavall等人建立了酶免疫测定方法(enzyme immunoassay,EIA)。
1975年,Koh ler和Mil-stein利用杂交瘤技术制备出单克隆抗体(McAb)。
但是由于各方面条件的限制,这两项技术在环境检测领域中的研究应用未引起足够的重视。
进入20世纪80年代, EIA首先应用到农药的检测中,1982年Huner和Wie分别报道了对硫磷和除虫脲的EIA法检测。
此后,EIA和McAb被广泛应用于各个领域的环境污染物的免疫分析。
1989年,美国环境保护局、农业部食品安全检验司和美国分析化学家组织共同制定了农药残留免疫学检验商品试剂盒评定和认可的建议准则。
免疫分析得到了大多数科学团体和执法机构的认可。
目前,至少有十几种商业免疫试剂盒被EPA认可。
2.1免疫分析技术在农药残留分析中的应用免疫测定技术在环境污染物上的应用首先是在农药方面的检测。
最初,大多数学者研究农药免疫分析技术的目的只是用于临床检测农药中毒病人血清、尿样和组织中的农药残留水平。
后来逐渐被环境研究者重视开始用于环境领域。
在环境方面的应用最早的是美国,他们把这一方法应用于地下水和河水中除草剂的检测分析中。
现在已经开发出几十种农药的免疫测定技术。
EIA技术可以用于检测水、土壤、食品中的各种农药残留,方法简便:决速前处理程序简化(不需净化),反应既可在试管中进行,也可在微孔板上进行;若在96孔板上,每次可分析几十个样品,A可同时作出标准曲线。
目前应用最多的是酶联免疫吸附(ELISA)测定法。
Seliske等[3]采用竞争ELISA法用兔抗白草枯抗体包被磁株固相检测百草枯,从各种水果和蔬菜中提取百草枯只用30 min,检出限为10 ng·L-1,平均回收率达99%,而用分光光度计法样品提取则击5 h,两种检测方法相关系数达0.994。
Schlaeppi等运用直接竞争ELISA法和间接竞争ELISA法分别检测土壤中的异内甲草胺,产生的抗异内甲草胺单克隆抗体有极强特异性,与其代谢产物无交义反应,直接和间接竞争ELISA法对土壤中异内甲草胺的回收率分别为98%和89%。
Brandon等在1994年制备了一种可以与苯并咪叶类药剂(内硫多菌灵、芬苯达叶、奥芬达叶及它们的代谢物)结合的单克隆抗体,该抗体也可与甲基苯并咪Ash氨基甲酸醋(苯菌灵的一种代谢物)结合。
新的半抗原5(6)-(烃基戊基硫代)- 2-苯并咪叶氨基甲酸醋可在大鼠体内得到,这种改进了的ELISA法可以检测苯并咪叶及多种农药,检出限为1-8μgkg-1。
我国的研究者也自行开发了许多EIA检测方法:①成功地合成了对硫磷人工抗原,并在免疫的兔了体内获得高效抗血清。
在此基础上,应用了ELISA法对梨、苹果中的对硫磷残留量进行检测,并以GC法验证,充分说明其具有良好的重现性。
②通过化学方法,将杀虫眯偶联到载体蛋白上制成抗原,然后免疫BA LB/ C小鼠。
经细胞融合、筛选、克隆等步骤,获得了抗杀虫眯的特异性抗体,并以该抗体建立了大米中杀虫眯残留量的单克隆抗体ELISA检测方法。
③应用B淋巴细胞杂交瘤技术,研制出特异性强的T-2毒素的单克隆抗体,并建立了小麦T-2毒素的ELISA检测方法。
[2]农业中应用举例:酶联免疫吸附分析法测定水样中的阿特拉津赵银丽等[4]利用免疫学原理合成恩诺沙星的完全抗原(BSA-ENR)免疫小鼠,然后应用细胞融合技术将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤,通过酶联免疫试验筛选分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以抗恩诺沙星的单克隆抗体(ENR mAb)为基础研制检测恩诺沙星残留的竞争ELISA试剂盒(competitive ELISA ENR-Kit) ,并测定其性能。
结果表明:筛选出的2株杂交瘤细胞,单抗亚类均为IgG1型,其中4G1-B3株的ENR mAb间接ELISA效价为1:1.024×106,亲和常数(Ka)为9×1010L/mol;竞争ELISA试剂盒的线性检测范围为0.05~101.6μg/L、灵敏度0.05μg/L、半数抑制浓度(IC50)1.1μg/L,与其他化合物的交叉反应率(CR%)均小于0.01 %,鸡肉样、鸡肝样、鱼肉样和牛奶样的平均添加回收率分别为81.5%、87.6%、84.3%和95%,不同基质添加恩诺沙星标准品做竞争ELISA 对ENR-Kit检测结果影响小,试剂盒保存期6个月以上。
检测所有样品的平均变异系数均小于10%,并且不同基质中添加标准品所建立的标准曲线非常相似,对检测结果影响小。
所以该试验建立的竞争ELISA方法可以对恩诺沙星在多种动物性产品中的残留进行检测,符合国家的检测标准。
结果说明该竞争ELISA试剂盒具有快速、敏感、特异、简便等特点,适用于ENR残留的快速检测。
2.2免疫分析技术在工业污染物上的应用工业污染物的免疫测定研究始于20世纪80年代,进入20世纪90年代后,研究者在前人的基础上进行了进一步的研究。
2002年,西班牙人Patricia Noguera, Rosa Puchades等改进了五氯酚(PCP)的酶免疫检测技术,他们将PCP的检测限提高到0.1ng·mg-1。
1997年,Harrion R O,Carlson R E,Carlson R E制备了2,3,7,8-TCDD的单克隆抗体,用竞争性抑制法建立了2种测定方法,一种是酶联管,检测灵敏度100pg·管-1,另一种是酶联板,检测灵敏度25 pg·孔-1。
1999年,Mei Liu,QingX Li,Garry A Rechnitz建立了PAHs的流动注射免疫测定技术。
Y su gawarea等用ELISA法测定2,3,7,8-TCDD的IC50值是12 pg·孔管-1,可测定的浓度范围是2-240 pg·孔槽-1,即40-480 pg·mg-1。
B E Watkins 等制备的单克隆抗体测定TCDD的IC50是200 pg·孔槽-1。
Y W Chiu等开发了共面PCB、3,4,3’,4’-PCB;3,4,3’,4’,5’-PCB的ELISA测定方法。
