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超低温冷冻对羯布罗香种子结构和生理生化特性的影响

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热带亚热带植物学报 2018, 26(3): 249 ~ 254 Journal of Tropical and Subtropical Botany收稿日期：2017-09-18 接受日期：2017-11-15基金项目：国家青年科学基金项目(81603399)；中央高校基本科研业务费专项(协和青年基金)(3332016071)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2016-I2M-2-003)资助This work was supported by the National Youth Science Foundation of China (Grant No. 81603399), the Basic Science Research Funds for the Central Universities (PUMC Youth Fund)(Grant No. 3332016071); and the CAMS Initiative for Innovative Medicine (CAMS-I2M)(Grant No. 2016-I2M-2-003). 作者简介：曾琳(1986~ )，女，助理研究员，研究方向为药用植物种子学。

E-mail: zenglin00186@ * 通信作者 Corresponding author. E-mail: zhengxl2012@超低温冷冻对羯布罗香种子结构和生理生化特性的影响曾琳, 顾雅坤, 吴怡, 郑希龙*(中国医学科学院药用植物研究所海南分所，海口570311)摘要：为长期、稳定、有效地保存羯布罗香(Dipterocarpus turbinatus Gaertn . F.)种子，探讨了低温冷藏对种子活力、结构和生理生化指标的影响。

结果表明，45%的含水量是种子的安全储藏含水量；玻璃化冷冻和缓慢冷冻对种子结构损害较大，且冷冻后的种子活力下降幅度大；快速冷冻法是种子超低温保存的最佳冷冻方式；液氮冷冻降低了种子过氧化物酶、过氧化氢酶和脱氢酶活性，提高了α-淀粉酶活性，而对丙二醛含量无显著影响。

因此，超低温保存羯布罗香种子是科学可行的。

关键词：超低温冷冻; 羯布罗香; 种子; 结构; 生理生化 doi: 10.11926/jtsb.3824Effect of Cryopreservation on Structure, Physiology and Biochemical Characteristics of Dipterocarpus turbinatus SeedsZENG Lin, GU Ya-kun, WU Yi, ZHENG Xi-long *(Hainan Branch Institute of Medicinal Plant Development , Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College , Haikou 570311, China)Abstract: In order to preserve effectively and stably the seeds of Dipterocarpus turbinatus Gaertn . F., the influence of low temperature storage on seed vigor, structure and physiological and biochemical indexes was studied. The results showed that the water content of seeds with 45% was safe for storage. The vitrification and slow freezing had more damage to seed structure, and the seed vigor decreased greatly. So, the best method for cryopreservation of seeds was the rapid freezing. The liquid nitrogen frozen reduced the activities of POD, CA T and dehydrogenase, and increased the activity of α-amylase, but had no significant effects on the content of MDA. Therefore, ultralow temperature preservation is scientific and feasible method for the seeds of D. turbinatus . Key words: Cryopreservation; Dipterocarpus turbinatus ; Seed; Structure; Physiological and biochemical羯布罗香(Dipterocarpus turbinatus Gaertn . F.)别名油树、龙脑香等，是龙脑香科(Dipterocarpaceae)常绿大乔木，为云南培育大径材的珍贵用材树种[1]。

其树干能分泌树脂，是提制龙脑、冰片和芳香油的原料[2]，同时也可作药用，具有清火解毒、杀虫止痒、凉血止血的功效[2]。

羯布罗香是典型的热带雨林树种，其种子不耐干燥和低温[3]，属顽拗性种子，常规方法只能保存3~4个月。

超低温保存是长期、稳定、有效保存顽拗性种子的最适方法[4]，本研究以羯布罗香种子为材料，运用不同的冷冻方式，对种胚进行液氮超低温保存，探讨液氮冷冻过程中种子发芽率、α-淀粉酶、脱氢酶、过氧化氢酶、过氧化物酶活性、丙二醛含量等生理生化指标变化的内在变化规律；并通过显微观察液氮处理的种子结构250 热带亚热带植物学报第26卷变化，探究超低温冷冻对种子结构的影响，为羯布罗香种质资源保护提供技术基础。

1 材料和方法1.1 材料成熟的羯布罗香(Dipterocarpus turbinatus Gaertn. F.)种子采自云南省西双版纳南药园，由国家南药基因资源库提供，初始含水量为60%，生活力100%，发芽率为90%，将种子含水量降至45%左右密封保存于4℃冰箱中备用。

试验材料为含水量45%的羯布罗香种胚块。

1.2 种子含水量测定将种子放于盛有硅胶的干燥器中干燥6 h，采用《国家农作物种子检验规程——水分测定》中的高温烘干法测定种子含水量。

1.3 种胚超低温冷冻采用快速冷冻、玻璃化冷冻和缓慢冷冻3种方法对含水量45%的羯布罗香种胚进行液氮超低温保存试验。

快速冷冻是将种胚块放入冻存管中直接投入液氮中保存；玻璃化冷冻是将含有种胚的种子块放入装载液LS (含2 mol L–1甘油+0.4 mol L–1蔗糖的MS液体培养基)中，室温浸润20 min后，倒掉LS，添加玻璃化冷冻保护剂PVS2 (含30%甘油+ 15%乙二醇+15%二甲亚砜+0.4 mol L–1蔗糖)，置于冰上处理30 min，倒出PVS2，添加新鲜的PVS2 (0℃),迅速投入液氮罐中保存。

缓慢冷冻是将PVS2 (25℃)浸润的种胚块置于4℃冰箱中，0.5 h后取出，立即放入-20℃冰柜中1 h，然后迅速投入液氮中。

1.4 解冻和生活力测定分别取出液氮冻存1、5、14 d的种胚块，用40℃水浴解冻2 min。

将玻璃化冷冻和缓慢冷冻处理的种胚用洗涤液US (含1.2 mol L–1蔗糖的MS培养液)洗涤3次，每次5 min，再用无菌水洗涤2次, 每次10 min。

然后采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)测定法检测其生活力，用1%的TTC于28℃黑暗放置4 h。

1.5 生理生化指标测定取对照组(未冷冻处理)和最佳冷冻组的种子各1.0 g，分别提取酶液，冷藏备用。

参照刘子凡[5]的3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定α-淀粉酶活性、TTC法测脱氢酶活性、紫外分光光度法测过氧化氢酶(CAT)活性、愈创木酚法测过氧化物酶(POD)活性。

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[6]测定。

1.6 显微观察取出种胚制备石蜡切片，先用FAA固定液固定24 h，然后依次用70%酒精、80%酒精、90%酒精、纯酒精、纯酒精各脱水2 h，再用50%酒精、50%二甲苯、二甲苯、二甲苯各处理1 h，埋蜡，切片，用二甲苯、二甲苯、纯酒精、纯酒精、95%酒精、85%酒精顺序脱蜡各5 min，依次用1%番红溶液染色16 h、70%酒精5 min、85%酒精5 min、0.5%固绿溶液9~13 s、95%酒精5 min；最后分别用纯酒精脱水30 s、纯酒精1~2 min、二甲苯30 s、二甲苯5~30 min。

封胶制成永久切片，显微观察。

1.7 数据分析采用SAS 9.3软件中的ANOV A方法对数据进行多重比较分析，以P<0.01表示差异极显著，P< 0.05为差异显著。

2 结果和分析2.1 含水量和冷藏时间对种子生活力的影响杨德军等[3]在常温下袋藏种子30 d的发芽率降至30%以下，干燥后储藏40 d以上的发芽率几乎为0。

本试验对初始含水量为60.57%的羯布罗香种子进行梯度脱水，获得含水量分别为50.35%、44.23%、40.50%、35.43%、30.23%和25%的种子。

含水量44%以上的种子生活力均为100%；含水量为40%时, 种子生活力降至80%；随着含水量的继续下降，种子生活力也继续降低；当含水量为25%时，种子生活力已低于30%。

羯布罗香种子极易发芽，将初始含水量的种子置于15℃种子柜中，仍继续发芽。

将含水量高于45%的种子储藏于4℃冰箱中，30 d后生活力降至30%以下；将含水量45%的种子储藏于4℃冰箱中90 d，其生活力仍有70%，但120 d后生活力降至10%左右。

可见，羯布罗香种子的安全储藏含水量为45%左右。

第3期曾琳等: 超低温冷冻对羯布罗香种子结构和生理生化特性的影响2512.2 超低温冷冻对种子生活力的影响由表1可见，羯布罗香种子液氮冻存1 d后, 玻璃化冷冻的种子生活力最高，缓慢冷冻法和快速冷冻的种子生活力均为75%；种胚冻存5 d，种子生活力都下降，其中玻璃化冷冻的种子生活力下降了44%；种胚冻存14 d后，玻璃化冷冻和缓慢冷冻的种子生活力分别急剧下降至26.10%和15.27%，而快速冷冻的种子生活力较冻存5 d的无显著差异,仍有60%。

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6种草本药用植物种子超低温保存技术研究论文

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6种草本药用植物种子超低温保存技术研究论文6种草本药用植物种子超低温保存技术研究论文超低温冷冻保存指将材料放置在低于-80 ℃的环境中保存，通常是用液氮（-196 ℃）作为贮藏源，大多数的植物种质在液氮中新陈代谢活动基本停止，处于“生机停顿”状态[1]，可以达到长期保存的目的。

因此已被广泛应用于生物种质的长期保存，应用范围也在不断扩大[2]。

目前超低温冷冻保存已成功应用于植物材料、动物干细胞、鱼虾精细胞、微生物等的保存。

其中植物材料包括种子、悬浮细胞[3]、愈伤组织[4]、胚[5-6]、花粉[7]、茎尖分生组织[8]、芽等。

国内外针对药用植物种子超低温保存的研究不多，李海兵等[9]对怀山药种质、何明高等[10]对束花石斛种子、任淑娟等[11]对七叶树种子、Hirano 等[12]对白芨种子进行了超低温保存，在药用植物种质超低温保存方式、种子含水量、化冻方式对超低温保存后种质存活率的影响取得了成果。

草本植物是区别于木本植物的一类植物的总称，包括重要的粮食如小麦、玉米等，且有很多草本植物是中药材的重要来源，例如黄芪、夏枯草、人参等。

本研究对具有药用价值的杜若、过江藤、夏枯草、皱果苋、罗勒和山香等6种草本药用植物种子进行超低温保存研究，对这些药用植物种子超低温保存的可行性和技术方法进行了探讨，为具有药用价值的草本植物的保护性开发提供技术。

1 材料与方法1.1 材料供试材料来自海南和广东的草本植物杜若、过江藤、夏枯草、皱果苋、罗勒和山香种子，由国家南药基因资源库提供（表1）。

1.2 方法1.2.1 种子含水量测定根据《国际种子检验规程》（ISTA编，1999）采用高温烘干法测定种子含水量（ω0），烘干温度（103±2）℃，烘干时间16 h。

ω0=（鲜重-绝干重）/鲜重×100%。

1.2.2 种子干燥采用硅胶干燥法。

将种子放入盛有硅胶的干燥器中，根据自然含水量经不同時间干燥分别获得含水量为13.50%（自然含水量）、11.90%、9.68%、7.89%和5.71%的杜若种子，含水量为11.20%（自然含水量）、10.69%、9.69%、8.44%和8.10%的过江藤种子，含水量为10.63%（自然含水量）、9.88%、8.02%和6.99%的夏枯草种子，含水量为16.18%（自然含水量）、13.88%、12.75%、10.67%和8.56%的皱果苋种子，含水量为26.33%（自然含水量）、20.87%、18.18%、13.86%和7.78%的罗勒种子和含水量为12.82%（自然含水量）、9.09%、7.63%、5.45%和4.55%的山香种子。

超低温对降香种子遗传变异和生理特性的影响

超低温对降香种子遗传变异和生理特性的影响

超低温对降香种子遗传变异和生理特性的影响作者：曾琳顾雅坤吴怡魏建和来源：《热带作物学报》2018年第09期摘要采用单因素随机区组试验方案探究降香种子玻璃化超低温保存最适条件，结合显微切片观察和生理生化特性检测对冷冻后细胞形态和生理生化指标变化进行分析，同时运用形态观察法和相关序列扩增多态性（SRAP）分子标记法对超低温保存后的降香植株遗传稳定性进行检测。

结果表明：降香种子玻璃化超低温保存最佳条件为：室温（25 ℃）装载25 min，0 ℃玻璃化脱水30 min，40 ℃水浴解冻5 min。

对比检测不同冷冻时间的降香种子超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、α-淀粉酶、脱氢酶活性、丙二醛（MDA）含量以及电导率等生理生化指标，无明显差异。

显微观察超低温保存前后的降香种胚内部结构，未见明显变化。

超低温保存后的降香种子发芽时，出现短暂的生长停滞期，恢复培养后，其表观形态指标与对照植株无明显差异。

SRAP技术分析了超低温冷冻前后的降香再生植株，其SRAP带型基本一致，未见明显差异带型。

综上表明，超低温保存降香种子是长期稳定、安全可靠的。

关键词超低温保存；降香；遗传变异；生理生化特性中图分类号 R931.2 文献标识码 AAbstract In this study， we used a single factor random block test to optimize cryopreservation procedure of Dalbergia odorifera T. Chen seed by vitrification. The embryo cells of Dalbergia before and after frozen were inspected with microscope by paraffin section method， and the change of physiological and biochemical indexes of seeds before and after frozen were analyzed. In addition，the genetic stability of regenerated plantlets after cryopreservation was tested with sequence—related amplified polymorphism （SRAP） molecular marker method. The results showed that the optimal conditions for Dalbergia odorifera seeds vitrification were 25 min loading condition at room temperature， 30 min dehydration condition at 0 ℃ and 5 min thawing condition at 40 ℃. The was no significant difference in seed physiological and biochemical indexes of different freezing time，and when inspected by microscope before and after cryopreservation， the internal structure of the embryo had no obvious variations. These results suggest that the time of cryopreservation had no significant effect on germplasm preservation of Dalbergia odorifera. When sprouted the seed of Dalbergia odorifera after freeze in liquid nitrogen， there had a short period of stagnation， but the morphological indexes did not vary greatly with those of the control after renewal cultivation. No nucleotide sequence had been altered during cryopreservation， which was indicted by no obvious differences in the banding patterns of DNA fragments between survival material and the controlmaterial of the Genomic DNA analyzed by SRAP after cryopreservation. In conclusion， the ultarlow- temperature preservation of Dalbergia odorifera seeds was stable， safe and reliable.Keywords cryopreservation； Dalbergia odorifera； genetic variation； physiological and biochemical traitsDOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.008自1973年Nag等[1]首次成功地将液氮超低温保存技术运用在胡萝卜悬浮培养细胞上以来，超低温保存技术已成功保存了近300种植物材料[2]。

种子生物学和生理生化基础—种子超低温贮藏的原理和技术

种子生物学和生理生化基础—种子超低温贮藏的原理和技术

《种子贮藏技术》
种子超低温贮藏的技术关键
种子超低温贮藏的技术关键
目录 CONTENTS
一 不同种类种子对液氮低温的反应差异 二 种子超低温贮藏的技术关键
五 六Βιβλιοθήκη 种子超低温贮藏的技术关键一、不同种类种子对液氮低温的反应差异
根据种子对液氮低温的反应，可将种子分为三 种类型。
(一)耐干燥又耐液氮的种子 多数农作物、园艺作物的种子,种子含水
不同种子的冷冻和解冻特性有差异，需分别探时， 以掌握合适的降温和升温速度。
（三）包装材料的选择
如种子与液氮直接接触，有些种子会发生爆裂。
种子超低温贮藏的技术关键
（四）添加冷冻保护剂
常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜(DMSO)、甘油、 PEG等。
（五）解冻后的发芽方法
量是关键因素，种子含水量过高则会在冷冻 和解冻过程中死亡。适合于冷冻保存的最高 含水量在植物种间有明显差异。
种子超低温贮藏的技术关键
（二）耐干燥对液氮敏感的种子
果树和坚果类作物，这类种子多数能干燥到含水量 10%以下，但是不能忍耐-40℃一下的低温。研究这 类种子的保存技术非常必要，因为这类种子多属于主 要经济作物，目前只能无性保存。
（三）对干燥和液氮均敏感的种子。
顽拗型种子，寿命很短，难以用超低温贮藏方法 保存。
种子超低温贮藏的技术关键
种子超低温贮藏的技术关键
种子超低温贮藏的技术关键
二、种子超低温贮藏的技术关键 （一）寻找适合液氮保存的种子含水量
只有在合适的含水量范围内，种子才能在液氯内存活。
种子超低温贮藏的技术关键
（二）冷冻和解冻技术
种子超低温贮藏【优质】PPT文档

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甘油、PEG等，使用冷冻保护剂的量应是足够到有冷冻保护作用，但 又不超过渗透能力和中毒的界限。
5.解冻后的发芽方法：液氮保存顽拗型种子难以成功，可能
与保存后的发芽方法不当有关，致使还有生活力的种子在发芽过程 中受损伤或死亡。
超低温贮藏的应用
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u极大地延长储藏种子的寿命， 而不产生遗传变异
从而有效地、 安全地长期保存那些珍贵稀有的种质资源,，起到了保存和抢救濒危物 种的作用。（例如红豆杉）
❖ 对于含水量高的种子, 可以采用组织培养与超低 种子超低温贮藏是指利用液态氮(-196℃)为冷源，将种子等生物材 料置于超低温下(一般为-196℃)，使其新陈代谢活动处于基本停止状
态，而达到长期保持（种子）寿命的贮藏方法。 科学的贮藏方法可以使种子寿命延长、生活力旺盛, 并且能保证作物出苗早、整齐、健壮; 但是如果贮藏方法不合理, 则种子易霉烂、变 质, 生活力降低, 播种后易造成缺苗、断垄, 给农户带来惨重的损失。 从而有效地、 安全地长期保存那些珍贵稀有的种质资源,，起到了保存和抢救濒危物种的作用。
u安全地保存许多植物的花粉、分生组织、芽、愈伤组织和细 胞等。 u利用液氮超低温保存花粉
已经在作物、蔬菜( 包括西甜瓜) 、果树 、花卉苗木、茶树、药材等植物上取得了
一定的进展。 利用液氮超低温保存花粉的一般程序是: 花粉采集→ 花粉干燥→花粉低温预处理→
❖ 超干贮藏 适合于长期保存珍贵稀有种质
在同一植物种中这个临界值有一个不大的变动范围，但是植物种间有明显的差异。 在同一植物种中这个临界值有一个不大的变动范围，但是植物种间有明显的差异。 2、外在因素对种子对液氮反应的影响 液氮保存的种子不需要特别干燥，能省去种子的活力监测和繁殖更新，是一种省事、省工、省费用的种子低温保存新技术。