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牛肠道病毒的分离鉴定

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牛肠道病毒的分离鉴定

李英利;常继涛;于力

【摘 要】A bovine virus was isolated from the fecal samples of dairy

cows/calves affected with diarrhea in China and identified as a bovine

enterovirus (BEV) by RT-PCR and sequence analysis. The typical

picornavirus particles were observed in infected cell by electron

microscope. A conserved sequence including partial 3D protein encoding

sequence and 3' UTR sequence (1,026 bp) of the isolate was amplified and

sequenced. The phylogenetic analysis indicated that the isolate,

designated BHM26,shared 71.9％ to 87％ nucleotide sequence identity

with the corresponding sequences of BEV reference strains in GenBank.

The results showed that the nucleotide sequence of isolate BHM26 had

some differences from BEV strains isolated from other countries.%本研究从内蒙古某奶牛场的犊牛粪便样品中分离的一株牛肠道病毒(BEV),命名为BHM26,通过电镜观察显示和分子生物学鉴定,发现病毒粒子在细胞浆中呈结晶状排列,单一病毒粒子呈典型小RNA病毒粒子形态,直径为25nm～30nm,无囊膜;病毒的部分3D蛋白编码区和全长3'UTR区段的1 026bpDNA片段的RT-PCR扩增和序列分析表明,其核苷酸序列与GenBank登录的参考病毒株核苷酸序列同源性为71.9%～87%,其中与BEV Wye-3A株同源性最高,为87%.分析表明中国BEV分离株与国外参考毒株具有较大差异.

【期刊名称】《中国预防兽医学报》

【年(卷),期】2011(033)005 【总页数】3页(P388-390)

【关键词】牛肠道病毒;分离;鉴定

【作 者】李英利;常继涛;于力

【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室,黑龙江,哈尔滨,150001

【正文语种】中 文

【中图分类】S852.65

牛肠道病毒(Bovine enterovirus，BEV)是小RNA病毒科肠道病毒属的成员。病毒粒子呈球形，二十面体，无囊膜，完整病毒粒子直径约为25 nm～30 nm。病毒基因组为不分节段的单股正链RNA，全长约为7.5 kb，可直接作为mRNA翻译出一个多聚蛋白，经过一系列降解，产生4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和

VP4)和 7种非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C 和 3D)[1]。1959年 Moll和Davis首次分离到BEV[2]，随后其他国家也相续有BEV的分离报道[3-5]。1988年Earle等首次发表了BEV的全基因组序列[6]，目前在GenBank登录的全基因组序列有12条。1993年，Smyth等获得了BEV粒子的晶体，并且展示了它的三维立体形态[7]。BEV对酸碱和温度具有较强的耐受能力。Sedmak等发现BEV是小鼠许多肿瘤疾病的融瘤因子[8]。因此，BEV在肿瘤疾病的防制和病毒载体的开发上具有潜在的应用价值。本研究从采自我国部分地区奶牛场的牛粪便拭子样品中分离出一株BEV，该病毒的分离在国内尚属首次。

1 材料和方法

1.1 病料及实验材料 牛粪便样品系2008年采自内蒙古某奶牛场，-70℃冻存；MA104细胞为本研究室保存；培养液为含8%胎牛血清的DMEM。

1.2 主要试剂 PrimeSTAR DNA聚合酶、Primescript反转录酶、Oligo(dT)引物均购自TaKaRa公司；TRIzol购自Gibco BRL公司；DNA胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。

1.3 样品处理 采集的粪便样品，用PBS制成1∶10(W/V)悬液，漩涡振荡器震荡，反复冻融3次，3000 r/min，4℃离心10 min，取上清，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，-70℃冰箱保存备用。

1.4 病毒的分离培养 经处理的粪便样品，接种MA104细胞单层，37℃吸附1 h，加入无血清的DMEM，5%CO237℃培养，每天观察细胞病变(CPE)。

1.5 病毒粒子的电镜观察 取病毒培养物上清，接种单层MA104细胞，6 h～8 h后，制备超薄切片进行电镜观察。

1.6 PCR引物的设计 参照GenBank中登录的BEV全基因组序列，选择保守区设计引物扩增包含部分3D基因和全长3'UTR区段的上下游引物。6424U24：5'-ATCCAAAGAGAAAGTGAAGAAGGG-3'； 7450L24： 5'-CCGGGGGCCTTTTTTTTTTTTTTT-3'。为调整下游引物的GC含量，在5'端引入了G、C碱基(引物下划线部分)。引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。

1.7 病毒RNA的提取及RT-PCR扩增 采用TRIzol试剂按产品说明书进行操作提取总RNA。细胞培养物的总RNA反转录合成cNDA链为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃ 5 min；94℃30 s、55℃30 s、72℃90 s，共30个循环；72℃10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.8 DNA序列测定及分析 RT-PCR产物胶回收纯化后，由英骏(中国)生物技术公司测序。利用DNAStar软件分析测序结果，并与国外具有的代表性参考病毒株进行序列比较分析。

2 结果与讨论

2.1 病毒的分离 粪便样品处理后的上清接种MA104单层细胞中进行病毒培养分离。传至第2代，细胞出现明显的CPE，表现为细胞皱缩变圆、边缘模糊、集聚和漂落(图1)。对分离的病毒进行3次蚀斑纯化，进行下一步的鉴定。

2.2 电子显微镜观察结果 单层细胞接种病毒后6 h～8 h，制备超薄切片，进行电子显微镜观察。在细胞质中可见匀称排列的病毒粒子的结晶，单个病毒粒子的直径大约25 nm～30 nm，无囊膜结构(图2)，与小RNA病毒的形态特征相符[9]。

2.3 病毒基因RT-PCR扩增 经过3次噬斑纯化的病毒，抽提RNA，用Oligo(dT)通用引物反转录合成cDNA第一链，用6424U24和7450L24引物进行PCR扩增，获得与预期大小(1026 bp)相符的目的基因片段(图3)。

2.4 序列比较分析 将PCR产物进行核苷酸序列测定，应用DNAStar软件将测得的序列与GenBank登录的BEV不同病毒参考株相应序列进行比较分析。结果表明，扩增的目的片段与参考病毒株的核苷酸序列同源性为71.9%～87%，同美国的Wye-3A株(AY508697)[10]的同源性最高，为87%(图4)。

本研究从犊牛粪便样品中分离到1株能够稳定产生CPE的病毒，经电镜观察、RT-PCR及序列分析鉴定，该分离病毒株为BEV，命名为BHM26。BEV可在患消化系统疾病、呼吸系统疾病及繁殖障碍性疾病的牛体内获得分离，也可以在正常牛体内获得分离，还可在环境中获得分离；而且，用BEV分离株进行感染试验，很难复制出相应的临床症状。因此，目前认为，BEV不具有致病性或仅有微弱的致病性。同时，BEV对酸碱具有较强的耐受能力，在环境中能够稳定存在，因此具有用于开发疫苗载体的潜在价值。

【相关文献】

[1]McCarthy F M,Smith G A,Mattick J S.Molecular characterisation of Australian bovine

enteroviruses[J].Vet Microbiol,1999,68:71-81.

[2]Moll T,Davis A A.Isolation and characterization of cytopathogenic enteroviruses from

cattle with respiratory disease[J].Am J Vet Res,1959,20:27-32.

[3]Carthew P,Martin S J.The iodination of bovine enterovirus particles[J].J Gen

Virol,1974,24:525-534.

[4]Dunne H W,Huang C M,Lin W J.Bovine enteroviruses in the calf:an attempt at

serologic,biologic,and pathologic classification[J].J Am Vet Med Assoc,1974,164:290-294.

[5]Acar A,Gur S.Seroprevalance of bovine enterovirus type 1(BEV1)in goats in Turkey[J].J

Anim Vet Advan,2009,8:1075-1078.

[6]Earle J A P,Skuce R A,Fleming C S,et al.The complete nucleotide sequence of a bovine

enterovirus[J].J Gen Virol,1988,69:253-263.

[7]Smyth M,Fry E,Stuart D.Preliminary crystallographic analysis of bovine enterovirus[J].J

Mol Biol,1993,231:930-932.

[8]Gerald V S,Milton W T.Oncology effect of bovine enterovirus on mouse and human

tumours[J].Nature New Biol,1972,238:7-9.

[9]Martin S J,Johnston M D,Clements J B.Purification and characterization of bovine

enteroviruses[J].J Gen Virol,1970,7:103-113.

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蛋鸡新城疫病毒的分离与鉴定

蛋鸡新城疫病毒的分离与鉴定

・２６・　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ＆Ｖｅ￣ｆｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｍｅ　２Ｏ０２　Ｖｏ１．３４　Ｎｏ．９　

蛋鸡新城疫病毒的分离与鉴定　

周锦萍，孙泉云，张苏华，沈　悦　

（上海市畜牧兽医站，上海２０１１０３）　

摘要：从上海某蛋鸡场发生的以产蛋下降及呼吸道病症为主的发病鸡群中分离到１株病毒。经ＨＡ、ＨＩ试验、病毒回归试验、血清中和接种鸡胚　试验，确认所分离毒株为新城疫病毒。测定分离株的鸡胚平均致死时间（ＭＤＴ）、１日龄雏鸡脑内致病指数（ＩＣＰＩ）和鸡胚半数致死量（ＥＩＤ￣ｏ）等　致病指数，表明属新城疫强毒。　关键词：鸡新城疫病毒；分离鉴定；致病性　

中图分类号：￥８５８．３１　文献标识码：Ｂ　文章编号：０５２９－５１３０（２００２）０９－００２６　

２０００年９月，上海市崇明县某蛋鸡场饲养的３　２００羽２９周　

龄蛋鸡，发生以产蛋下降及呼吸道病症为主的疾病。病鸡呼吸　

频数、气喘并有罗音，产蛋从９成降至３成，并产出畸形蛋、　

沙壳蛋、软壳蛋，病程５—７　ｄ。每天死亡鸡ｌ０—６ｏ只不等，　

共死亡１　０９６羽，死亡率３４．２５％。剖检症状为肝淤血、脑水　

肿，个别鸡腺胃有出血点，使用各类抗生素无效。为了查明发　

病原因，我们进行了病原分离鉴定工作。　

ｌ材料　

９日龄ＳＰＦ鸡胚和１日龄ＳＰＦ雏鸡，由南京药械厂提供。　

新城疫（ＮＤ）、减蛋综合征（ＥＤＳ）、禽流感（Ａｊ）阳性血　

清和抗原，由哈兽研提供。　

ＮＤＶ　Ｆ４８Ｅ８毒株，由南京农业大学动物医学院提供。　

２方法　

２．１血清的采集和相关疫病检测　

无菌采集病鸡及同群鸡血样４０份，分离血清，作ｍ试验　

以检测ＮＤ、ＥＤＳ、ＡＩ抗体。　

２．２病毒分离　

２．２．１病料的采集和处理　

分别取ｌ０个典型病死鸡的气管、肝脏、脑组织，加无菌　

ＰＢＳ（０．Ｏ１　ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ　７．２）剪碎研磨后制成１０％悬液。冻融３—　

４次后置超声波裂解仪中作用４　ｍｉｎ，４　０００　ｒ／ｍｉｎ离心２０　ｍｉｎ。　

一株腺病毒的分离与鉴定

一株腺病毒的分离与鉴定

・３０５８・　一株腺病毒的分离与鉴定　李冰洁　ｌ５年第３６卷第２Ｏ期Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＯｉｑｉｈａｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５．Ｖ０１．３６．Ｎ０．２０　．技术・方法．　【摘要】　目的对流感样病例咽拭子标本进行病原分离与鉴定，为腺病毒的分离及鉴定提供方法。　方法对所采集的咽拭子标本，用多重ＰＣＲ的方法确定含腺病毒的标本，用细胞培养的方法分离病毒，对　引起ＨＥＰ－２细胞病变的病毒用荧光定量ＰＣＲ方法加以确定。结果从流感样病例咽拭子分离到一株病　毒，经鉴定为腺病毒。结论腺病毒可以用细胞ＨＥＰ－２进行分离，可以用多重ＰＣＲ及荧光定量ＰＣＲ方法　进行鉴定。　【关键词】腺病毒；核酸检测；分离；鉴定　Ｉｓ￣ａｆｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　Ｍ　Ｂｉｎｇ－ｊｉｅ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｆｕ３ｈｕｎ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｈｏｏｌ，Ｆｕｓｈｕｎ．Ｌｉａｏｎｉｎｇ，ｌ１３０ｏ８。Ｃｈｉｎａ．　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔａｋｉｎｇ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ—ｌｉｋｅ　ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ　ｓｗａｂ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｕｓｉｎｇ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ａｎｄ　ｉｓｏｌａｔｉｎｇ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｗｉｔｈ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｔｈｏｄ．　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｖｉｒｕｓ　ｗｈｉｃｈ　ｃａｕｓｅ　ＨＥＰ－２　ｃｅｌｌ　ｌｅｓｉｏｎ　ｂｙ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｏａｔ　ｓｗａｂ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ—ｌｉｋｅ　ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ　ｓｗａｂ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｓ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ　ＨＥＰ一２　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｃａｎ　ｂｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｍｕｌｔｉ１３１ｅｘ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　急性上呼吸道感染是指鼻腔、咽或喉部的急性炎症的总　称。临床表现以发热、流涕、咳嗽为主。主要病理改变为鼻、　咽黏膜充血、水肿、上皮细胞破坏、少量单核细胞浸润，有浆液　性及黏膜性渗出，继发细菌感染后，可有脓性分泌物。引起上　呼吸道感染的病原９０％以上是病毒，腺病毒（ＡＤＶ）就是其中　的一种病毒。２０１４年ｌ１月我们从抚顺市中心医院门诊采集　的咽拭子标本中就成功的分离出一株腺病毒并对其进行了鉴　定。　一、材料及方法　１．标本的采集和处理：在２０１４年１１月抚顺市中心医院　门诊采集１１名流感样病例、发病３日内的临床诊断患者咽拭　子标本，采集后立即投入装有病毒采样液的小试管中冷藏运　输至实验室。标本一部分用于核酸提取并进行ＰＣＲ检测，另　一部分一７０℃冰箱冻存用于病毒分离。　２．病毒分离：将咽拭液４　ｏＣ，１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心２０　ｍｉｎ。　取０．１　ｍｌ上清液接种ＨＥＰ一２细胞，置３５℃、５％ＣＯ，培养箱，　１　ｈ后弃去接种液体，加入７　Ｉｌｌｌ细胞维持液（血清含量为　２％），细胞置于３５℃、５％ＣＯ　培养箱中继续培养，逐日观察　细胞病变；在ＨＥＰ－２细胞中连续盲传３代，弃去无病变者，将　发生病变者连续传代，使之出现规律病变。　３．病毒核酸提取：实验采用ＱＩＡＧＥＮ公司的ＥＺ１　Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＸＬ全自动核酸提取仪，使用ＥＺ１　Ｖｉｒｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　Ｖ　２．０（Ｃａｔ．Ｎｏ．９５５１３４）进行核酸提取，具体步骤参考说明书。　４．病毒核酸检测：采用Ｐｒｏｍｅｇａ＠Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（美国ＱＩＡＧＥＮ公司）和Ｓｅｅｐｌｅｘ＠ＲＶ１２　ＡＣＥ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　（美国Ｓｅｅｇｅｎｅ公司）多重检验试剂盒进行ＰＣＲ反应，并进行　琼脂糖凝胶电泳，ＰＣＲ产物目的片段约５３４ｂｐ。　用Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ—ＰＣＲ检测方法，使用江苏硕世公司腺病毒检　作者单位：１　１３００８辽宁，抚顺市卫生学校检验教研室　测试剂盒进行检测。扩增反应体系和条件按照说明书操作和　设置，在ＡＢ１７５００型荧光定量ＰＣＲ仪上进行。　二、结果　１．标本的核酸检测结果：我们将所采集的１１份标本提取　病毒ＤＮＡ，采用Ｐｒｏｍｅｇａ＠Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（美国　ＱＩＡＧＥＮ公司）和Ｓｅｅｐｌｅｘ＠ＲＶ１２　ＡＣＥ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（美国Ｓｅｅｇｅｎｅ　公司）多重检验试剂盒进行呼吸道病毒鉴定，经电泳鉴定，标　本１１号所检测ＰＣＲ产物条带大小与腺病毒相吻和，表明１１　号标本中所含病毒为呼吸道腺病毒。见图１。　图１呼吸道病毒鉴定凝胶电泳图　注：缓冲液为１×ＴＢＥ；Ｍａｒｋｅｒ为试剂盒自带。图为Ａ反应，反应Ａ的　Ｍａｒｋｅｒ条带从上至下依次为Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ（１０００ｂｐ），Ｈｕｍａｎ　ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ（７４９ｂｐ），Ｈｕｍａｎ　ａｄｃｎｏｖｉｒｕｓ（５３４ｂｐ），Ｈｕｍａｎ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　２２９Ｅ／ＮＬ６３（３７５ｂｐ），Ｈｕｍａｎ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ２（２６４ｂｐ），　Ｈｕｍａｎ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕ￣（１８８ｂｐ），Ｈｕｍａｎ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｍｓｌ　（１３９ｂｐ）。　２．感染细胞病变及病毒分离：将１１号咽拭液标本接种　ＨＥＰ一２细胞后，接种细胞于４８小时左右出现细胞病变，病变　开始表现为细胞变形变圆，排列紊乱，细胞成拉网状；７２小时　左右病变达到高峰，表现为细胞圆缩、聚集和脱落。见图２。　３．病毒培养液的核酸检测结果：我们从培养７２小时左右　的病变细胞中提取病毒ＤＮＡ，用Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ．ＰＣＲ检测方法，使　用江苏硕世公司腺病毒检测试剂盒进行检测，阳性检测结果　的判定标准是：样品的ＣＴ值小于３５．５且有典型的标准曲线，　同时实验设立阴性、阳性对照。经检测，

羊口疮病毒的分离与鉴定

羊口疮病毒的分离与鉴定

２２　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏ１．３２　Ｎｏ．９　２００２　

被广泛用于ＭＤ的预防　。但由于ＭＤＶ倾向于向更高的毒力　

突变。导致了疫苗免疫效力的降低。因此，现在迫切要求研制新　

一代比较好的疫苗。　

３．２本研究观察了构建的含有ＭＤＶ—ｇＢ基因的ｒＦＰＶ免疫保　

护效果。攻毒后各组鸡死亡率及保护率显示，ｒＦＰＶ组、ＨＶＴ组　

和ｒＦＰＶ＋ＨｖＴ组鸡群的死亡率分别为３３　、３３　和１７　；相　

对应各组鸡群的保护率分别为６７　、６７　和８３　。显示ｒＦＰＶ　

组和ＨＶＴ组的免疫保护效果一致，但低于ｒＦＰＶ４－ＨＶＴ二联　

疫苗的免疫保护效果，说明ｒＦＰＶ和ＨＶＴ冻干疫苗具有免疫　

协同作用。　

３．３试验还测定了疫苗免疫后对各组鸡群体重的影响情况。　结果显示，攻毒后各免疫组鸡群的体重基本一致．但明显高于单　

纯攻毒组，低于正常对照组。　３．４随着对ＭＤＶ基因组结构与功能的深入研究以及对ＭＤＶ　

致病机理的认识，国内外研究者正在寻求安全、高效的ＭＤ疫　

苗。ｒＦＰＶ疫苗的研制将为ＭＤ的预防作出贡献。　

参考文献：　

［１］殷震，刘景华．动物病毒学［Ｍ］．第２版．北京：科学出版　

社。１９９７．　

［２］　Ｗｉｔｔｅｒ　Ｒ　Ｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｍａｒｅｋ’Ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ：Ａ　

ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｕｔｕｒｅ　ＦＪ］．Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ。１９９８．７７：　

１１　９７—１　２Ｏ３．　

羊口疮病毒的分离与鉴定　

何水林，陈　杰，蔡玉书，姚龙涛　

（上海市奉贤区畜牧兽医站，上海奉贤　２０１４００）　

摘要：从发病山羊中分离到１株羊口疮病毒，在犊牛睾丸细胞上产生明显的ＣＰＥ。感染２月龄羊及成年兔均可产生与　

自然发病相同的症状，接种２日龄小鼠则无任何症状出现；电镜观察该病毒颗粒呈椭圆形，有囊膜，大小在２２５　ｎｍ×１２５　

牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定

牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定

CHINA FOOD SAFETY 121分析检测牛肉样品中产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠致病性大肠埃希氏菌的分离鉴定朱应飞，聂　翔，熊丽霞，吴学平，占忠旭，匡佩琳（江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院，江西南昌 330000）摘　要：于2018年9月—2019年3月，每个月从超市和农贸市场中抽取20个样本，共抽取140个牛肉及制品样本，在qPCR初筛时stx阳性率为45.8%，eae的阳性率为52.2%。每月的stx初筛阳性率分别为65%、60%、80%、5%、25%、45%和40%；eae初筛阳性率分别为70%、70%、65%、0%、40%、65%和55%。检出携带stx基因的产类志贺毒素大肠埃希氏菌样本4份，样本阳性菌株检出率为2.9%；检出携带eae基因的肠致病性大肠埃希氏菌样本12份，样本阳性菌株检出率为8.6%。关键词：产志贺毒素大肠埃希氏菌；肠致病性大肠埃希氏菌；分离；鉴定Isolation and Identification of Shiga Toxin Producing Escherichia coli and Enteropathogenic Escherichia coli in Beef SamplesZHU Yingfei, NIE Xiang, XIONG Lixia, WU Xueping, ZHAN Zhongxu, KUANG Peilin(Jiangxi General Institute of Testing and Certification Food Testing Institute, Nanchang 330000, China)Abstract: From September 2018 to March 2019, 20 samples were taken from supermarkets and farmers’ markets every month, with a total of 140 beef and product samples taken. the positive rate of stx was 45.8%, and the positive rate of eae was 52.2%. The monthly positive rates of stx initial screening positive rates of 65%, 60%, 80%, 5%, 25%, 45%, and 40%, respectively; The positive rates of eae initial screening were 70%, 70%, 65%, 0%, 40%, 65%, and 55%, respectively. Four Shiga toxin producing Escherichia coli samples carrying the stx gene were detected, with a positive strain detection rate of 2.9%; From September 2018 to March 2019, 12 samples of enteropathogenic Escherichia coli carrying the eae gene were detected, with a positive strain detection rate of 8.6%.Keywords: Shiga toxin producing Escherichia coli; enterogenic Escherichi coli; separation; appraisal产志贺菌毒素的大肠杆菌（Shiga Toxin Producing Escherichia coli，STEC）和肠致病性埃希氏菌（Enterogenic Escherichi coli，EPEC）是世界上最重要的食源性病原体之一。牛羊等动物作为STEC和EPEC的宿主，可通过粪便污染肉食对人们的健康造成危害[1]。STEC可引起溶血性尿毒症综合征，甚至可能导致死亡[2]。EPEC可引起急性或持续性腹泻，多发于两岁以下的儿童。通常，EPEC会引起急性水样腹泻，并伴有发烧、呕吐和脱水，该病发病迅速，在摄入细菌后几小时后出现症状[3]。本研究旨在用传统平板分离法结合分子生物学方法对江西省南昌市市售牛肉样品中的STEC和EPEC进行分离鉴定。1　材料与方法1.1　仪器与试剂恒温培养箱，上海智诚；实时荧光PCR仪，伯乐；改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基，新生霉素、营养琼脂，北京陆桥；CHROMagar STEC显色培养基，科玛嘉；改良Rainbow O157显色培养基，Biolog；引物和探针，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。基金项目：江西省市场监督管理局科技项目（GSJK202104）；江西省检验检测认证总院科研项目（ZYK202212）。作者简介：朱应飞（1978—），男，湖南浏阳人，本科，高级工程师。研究方向：卫生检验。通信作者：匡佩琳（1965—），女，江西泰和人，本科，主任药师。研究方向：药学。E-mail:138****************。122 食品安全导刊 2023年10月（上）分析检测