氨基酸总量的测定

第八章 食品氨基酸总量的测定【教学目标】：1.掌握氨基酸、含氮量等的概念和相关知识；2.掌握氨基酸液氮的测定方法和操作技能；3.了解比色法的原理，基本方法及仪器使用和维护的知识。

一、甲醛滴定法1原理氨基酸具有酸性的一COOH 基和碱性的一N 2H 基。

它们互相作用使氨基酸成为中性的内盐。

加入甲醛溶液时，一N 2H 基与甲醛结合，其碱性消失。

这样就可能用碱来滴定一COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸的量。

用碱完全中和一COOH 基时的pH 值为8.4~9.2。

2试剂（1）40%中性甲醛：用百里酚酞作指示剂，将甲醋用碱溶液中和至淡蓝色。

（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。

（3）0.1N 氢氧化钠标准溶液。

3操作方法称取粉碎样品5.00~10.00g 或液体样品5~10mL,置于烧杯中，加入50mL 水和活性碳约5g ，加热煮沸，过滤，用30~40mL 热水洗涤活性碳，收集滤液于三角瓶中，加入3滴百里酚酞指示剂，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。

加入中性甲醛20mL ，摇匀，静置1min ，此时蓝色已经消失，再用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。

记录第二次滴定时消耗的碱液毫升数。

4计算氨基酸态氮（%）=100014.0⨯⨯⨯WV N 式中：N----氢氧化钠标准溶液的当量浓度；V----氢氧化钠钠标准溶液的消耗量（第二次）（g ）;W----样品溶液相当于样品的量（g ）;0．014----氮的毫克当量。

5说明（1）用碱性溶液第一次滴定时，用pH 计控制滴定到溶液pH7.5后，然后加入中性甲醛继续用碱液滴定，又用pH 计控制用碱液滴定样液至pH9.2为终点较为正确。

（2）取相同2份样品溶液，其中1份加入中性红指示剂3滴，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至琥珀色为终点，另1份加入百里酚酞指示剂3滴和中性甲醛20mL ，静置1min 后，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。

按下列、公式计算：100014.0)((%)12⨯⨯-⨯==WV V N X 氨基酸 式中： 2V ------用百里酚蓝作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL ）；1V ------用中性红作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL ）；N ------标准氢氧化钠溶液的当量浓度；W------样品重量（g ）；0.014----氮的毫克当量。

实验2 氨基酸的总量测定和纸层析分离鉴定Ⅰ甲醛滴定法测定氨基氮一、实验目的初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。

二、实验原理氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：R CHNH3+COO-R CH NH3+COO-2+H+,是弱酸，完全解离时pH为11～12或更高，若用碱滴定—NH3+所释放的H+来测量氨基酸，一般指示剂变色减小于10，很难准确指示终点。

常温下，甲配合能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使—NH3+释放H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（pH9.0左右）。

因此，可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。

R CHNH3+COO-R CH COO-2+HR CH COO-NHCH2OHR CH COO-中和2OH)2如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量1。

如样品是多种氨基酸的混合物，如蛋白水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。

但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度。

随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表示水解作用已完全。

三、实验器材25 ml锥形瓶，3 ml微量滴定管，吸管。

0.1 mol/L标准甘氨酸溶液：准确称取750.7 mg甘氨酸，溶解后定容至100 ml。

0.1 mol/L标准氢氧化钠溶液21脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定ml数偏低。

酪氨酸的滴定ml数偏高。

2标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。

不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。

酚酞指示剂：0.5%酚酞的50%乙醇溶液 中性甲醛溶液：在50 ml 36～37%分析纯甲醛溶液中加入1 ml 0.1%酚酞乙醇水溶液，用0.1 mol/L 的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。

此试剂在临用前配制。

如已放置一段时间，则使用前需重新中和。

四、实验步骤1．取3个25 ml 的锥形瓶，编号。

向第1、2号瓶内各加入2 ml 0.1 mol/L 的标准甘氨酸溶液和5 ml 水，混匀。

氨基酸总量的测定(茚三酮比色法)一、方法原理：氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，可产生二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，据此可以比色测定氨基酸含量。

二、试剂：1．2％茚三酮溶液：1g茚三酮(C9H403·2H2O)溶于25ml热水中，加入40mg氯化亚锡；(SnCl2·2H2O)，搅拌溶解，滤去残渣，滹液放在冷暗处过夜，用水定容为50ml，保存声冷暗处。

如茚三酮有微红色，配成的溶液也带红色，将影响比色测定，需将茚三酮重结晶后再用方法是：取5g茚三酮溶于20ml热水中，加入0.2g活性炭，轻轻摇动，放三十分钟后过滤，滤液置冰箱中过夜，次日过滤，用1ml冷水淋洗结晶，然后放在干燥器中干燥，装瓶保存。

2。

磷酸盐缓冲液(pH8.0)：①1／15mol/l磷酸二氢钾溶液：取KH2P04 0.9070g溶于lOOml水中。

②1／15mol/l磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)23.876g溶于水，加水至1000ml。

取①50ml与②95ml混匀即得。

3．10％醋酸：取lOml冰醋酸加水至lOOml。

4，氨基酸标准溶液(200ppm)：称取干燥的氨基酸(白氨酸，或其它的氨基酸)0.2000g溶解于水，定容为1000ml。

三、仪器：水浴，721分光光度计。

四、操作步骤：(一)标准曲线绘制：分别吸取氨基酸标准溶液(200ppm)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml各置于25ml容量瓶中,加水补充至4.0ml，各加入缓冲液lml，加入茚三酮lml，摇匀。

置沸水浴中加热15分钟，取出迅速冷却至室温，—用水定容。

放置15分钟，在570nm波长下测定，绘制标准曲线。

氨基酸浓度分别为0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.Oppm。

(二)样品测定：l提取样品：称取1.0 ~2.0g植物样品(新鲜样或干样)，加5m1 10％醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入lOOml容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。

样品前处理
一、前处理方法
氨基酸总量的测定需要三种方法。

通常我们使用酸水解法测定
天冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，谷氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丙氨
酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，组氨酸，精氨酸等15种氨基酸，用氧化水解法测定胱氨酸和蛋
氨酸，用碱水解法测定色氨酸。

在酸水解过程中色氨酸被全部
破坏，无法测定，含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸）会被部分氧
化，无法侧准。

二、采样
样品须具有代表性，用四分法缩减分取25克左右，粉碎并通过
0.25mm孔径（60目）筛，充分混匀后待测。

由于氨基酸在氧
及碳水化合物存在下易破坏，所以样品粉碎时温度不能过高，
需低于50度。

对于粗脂肪含量大于或等于5%的样品，需先脱
脂，然后风干，混匀备用。

酸水解的样品应先测定粗蛋白的含
量。

样品的称量需用万分之以上天平。

三、前处理步骤
1、酸水解
A、称取含蛋白7.5-25mg的样品于20ml安培瓶中（切勿贴壁）
B、加入10ml 6mol/L盐酸，抽真空至小于7Pa后，冲氮气，再
抽真空充氮气，如此重复三次后，在充氮气情况下封口或拧紧螺丝盖。

C、封口后的安培瓶放入110度恒温干燥箱内水解22-24小时
D、冷却、混匀、开管、过滤，定容于25毫升容量瓶，取适量
滤液置于旋转蒸发仪中，60度以下抽真空，蒸干，加少
许水，反复1-2次
E、加入3-5ml PH2.2稀释液，使浓度达到50-250nmol/ml。

混
匀后过0.45微米滤膜，或10000转离心10分钟，后取上清，待上机用。

实验一植物组织中氨基酸总量的测定(茚三酮比色法)一、目的意义和要求：二、原理：三、植物材料：1、发芽水稻种子：用水(对照)、50mmol/L NaCl和500mmol/L NaCl溶液分别浸种２天后，室温（28℃）下萌发２天。

2、每组用２种材料，即１种对照和１种NaCl处理。

四、试剂配制 :1.水合茚三酮试剂: 称取0.6克再结晶的茚三酮置烧杯中，加入15毫升正丙醇，搅拌使其溶解。

再加入30毫升正丁醇及60毫升乙二醇，最后加入9毫升pH5.4的乙酸—乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，置冰箱中保存备用，10天之内有效。

2. 乙酸—乙酸钠缓冲液（pH为5.4）：称取化学纯乙酸钠54.4克，加100毫升无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至原体积的一半。

冷却后加30毫升冰乙酸，用无氨蒸馏水稀释至100毫升。

3. 标准氨基酸：称取80℃下烘干的亮氨酸46.8毫克，溶解在10%的异丙醇中，并用10%异丙醇稀释至100毫升。

取此液5毫升，用蒸馏水稀释至50毫升，即为每毫升含氮5微克的标准液。

4.0.1%抗坏血酸：称取50毫克抗坏血酸溶于50毫升无氨蒸馏水中，随用随配。

五、操作步骤：1、样品制备：称取水稻萌发种子1克于研钵中，加入2ml10%乙酸、石英砂，充分研成匀浆，再加入3ml10%乙酸，研磨均匀后用蒸馏水洗入100ml容量瓶并用蒸馏水定容至100ml。

混匀后用干燥滤纸过滤到三角瓶中备用。

2、标准曲线的绘制：取8支试管，按下表编号、加试剂。

2、样品测定：取3支20ml刻度试管，按下表编号、加试剂。

加完试剂后，混匀，盖上玻塞，置沸水浴中加热15分钟，然后取出放在冷水浴中迅速冷却并经常摇动，使加热时形成的红色逐渐被空气氧化而褪色，直至溶液呈蓝紫色时，用60%的乙醇定容至20毫升，摇匀，用光径为1厘米的比色杯，在波长570nm下测定其消光值，制作标准曲线。

3、样品测定：取2支试管，分别加入2亳升过滤液，加入0.1%抗坏血酸0.1毫升，水合茚三酮3ml,混匀加盖，置沸水浴加热15min，取出后用冷水迅速冷却，用60%乙醇定容至20ml。

实验20植物组织中游离氨基酸总量的测定第一篇：实验20植物组织中游离氨基酸总量的测定实验20植物组织中游离氨基酸总量的测定茚三酮显色法氨基酸是组成蛋白质的基本单位也是蛋白质的分解产物。

植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输。

所以测定植物组织中不同时期、不同部位游离氨基酸的含量对于研究根系生理、氮素代谢有一定意义。

一、原理氨基酸与茚三酮共热时能定量地生成二酮茚胺。

该产物显示蓝紫色称为 Ruhemans 紫。

其吸收峰在 570 nm 而且在一定范围内吸光度与氨基酸浓度成正比。

氨基酸与茚三酮的反应分两步进行第一步氨基酸被氧化形成 CO 2、NH 3 和醛茚三酮被还原成还原型茚三酮第二步所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和一分子氨脱水缩合生成二酮茚–二酮茚胺 Ruhemans 紫反应式如下在一定范围内反应体系颜色的深浅与游离氨基的含量成正比因此可用分光光度法测定其含量。

二、实验材料、试剂与仪器设备一实验材料各种植物组织。

二试剂 1.水合茚三酮试剂称取 0.6 g 再结晶的茚三酮置烧杯中加入 15 mL 正丙醇搅拌使其溶解。

再加入 30 mL 正丁醇及 60 mL 乙二醇最后加入9 mL pH5.4 的乙酸–乙酸钠缓冲液混匀贮于棕色瓶置4 ℃下保存备用10 d 内有效。

2.乙酸–乙酸钠缓冲液 pH 5.4 称取乙酸钠 54.4 g 加入100 mL 无氨蒸馏水在电炉上加热至沸使体积蒸发至 60 mL 左右。

冷却后转入100 mL 容量瓶中加30 mL 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至100 mL。

3.标准氨基酸称取80 ℃下烘干的亮氨酸 46.8 mg 溶于少量10 异丙醇中用 10 异丙醇定容至 100 mL。

取该溶液 5 mL 用蒸馏水稀释至 50 mL 即为含氨基氮5 μ g/mL 的标准氨基酸溶液。

4.0.1 抗坏血酸称取 50 mg 抗坏血酸溶于 50 mL 无氨蒸馏水中随配随用。

氨基酸总量(氨态氮)的测定一、目的与原理：1、了解掌握单指示剂与双指示剂甲醛滴定法测氨基酸总量的方法与原理：二、单指示剂甲醛滴定法：(一)原理：氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基显示酸性，又含有-NH2基显示碱性。

由于这二个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。

当参加甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反响式可能以下面三种形式存在。

〔二〕试剂(1)40％中性甲醛溶液，以麝香草酚酞为指示剂，用1N NaOH溶液中和。

(2)0.1％麝香草酚酞乙醇溶液。

(3)0.100N氢氧化钠标准溶液。

(三)操作步骤：称取一定量样品(约含20毫克左右的氨基酸)于烧杯中(如为固体加水50毫升)，加2-3滴指示剂，用0.1OON NaOH溶液滴定至淡蓝色。

参加中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此时蓝色应消失。

再用0.1OON NaOH 溶液滴定至淡蓝色。

记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算计算：氨基酸态氮(％)=( N V×0.014×100)/W式中：N：NaOH标准溶液当量浓渡。

V：NaOH标准溶液消耗的总量(m1)W：样品溶液相当样品重量(克)。

0.014：氮的毫克当量。

三、双指示剂甲醛滴定法：(一)原理：与单色法一样，只是在此法中使用了两种指示剂。

从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂，不作介绍)相近单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液PH值作为麝香草酚酞的终点。

PH值在9.2，而双指示剂是以氨基酸溶液的PH 值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法较为准确。

(二)试剂：(1)三种试剂同单指示剂法(2)0.1％中性红(50％乙醇溶液)(三)操作步骤：取一样的两份样品，分别注入100毫升三角烧瓶中，一份参加中性红指示剂2-3滴，用0.100N NaOHOH准溶液滴定至淡蓝色。

食品中氨基酸总量的测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定食品中氨基酸的总量，了解食品中蛋白质的营养价值，并掌握氨基酸总量测定的基本原理和方法。

二、实验原理氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。

食品中的氨基酸可以通过与某些试剂反应，产生可检测的物质，从而进行定量分析。

本实验采用茚三酮比色法测定氨基酸总量。

茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸加热反应，生成蓝紫色化合物，其颜色的深浅与氨基酸的含量成正比。

通过比色测定吸光度，与标准曲线对照，即可计算出样品中氨基酸的总量。

三、实验材料与设备1、实验材料待测食品样品（如鸡蛋、牛奶、肉类等）标准氨基酸溶液（已知浓度）茚三酮试剂磷酸缓冲液（pH 54）乙醇蒸馏水2、实验设备分光光度计恒温水浴锅容量瓶（100 mL、50 mL、25 mL 等）移液管（1 mL、2 mL、5 mL 等）具塞刻度试管（25 mL）漏斗滤纸四、实验步骤1、样品处理称取适量的待测食品样品，精确至 0001 g，置于研钵中研磨成匀浆。

将匀浆转移至容量瓶中，用蒸馏水多次冲洗研钵，洗液并入容量瓶中，定容至刻度，摇匀。

用滤纸过滤上述溶液，滤液备用。

2、标准曲线的绘制分别吸取 00 mL、02 mL、04 mL、06 mL、08 mL、10 mL 标准氨基酸溶液于 25 mL 具塞刻度试管中，用蒸馏水补充至 10 mL。

向各试管中加入 10 mL 磷酸缓冲液（pH 54）和 10 mL 茚三酮试剂，摇匀。

将试管置于沸水浴中加热 15 min，取出后迅速冷却至室温。

用蒸馏水定容至 25 mL，摇匀。

以蒸馏水为空白对照，在 570 nm 波长处测定各溶液的吸光度。

以氨基酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3、样品测定吸取 10 mL 样品滤液于 25 mL 具塞刻度试管中，按照绘制标准曲线的步骤进行操作，测定样品溶液的吸光度。

五、实验结果与计算1、实验结果记录标准曲线各点的浓度和吸光度。