酶法提取虎杖中白藜芦醇新工艺研究

酶法提取虎杖中白藜芦醇新工艺研究XIA NG H Y向海艳,周春山*,陈龙胜,雷启福(中南大学化学化工学院,湖南 长沙 410083)摘 要: 采用纤维素酶解法新工艺提取虎杖中白藜芦醇。

即在乙醇提取前,先用纤维素酶处理虎杖粗粉。

通过实验确定最佳的提取工艺条件为:提取温度50 ,酶解pH 值5.0,酶解时间90min,纤维素酶与虎杖粗粉配比为1 500。

与传统醇提工艺相比,提取率提高了近5倍。

关键词: 纤维素酶;酶处理;白藜芦醇;虎杖中图分类号:T Q 91;Q 949.744 文献标识码:A 文章编号:0253-2417(2004)04-0077-04ST U DY ON ENZY MAT IC EXT RA CT ION OF RESVERAT ROLFROM POL YGON UM CUSPIDA T UMXIANG H a -i yan,ZH OU Chun -shan,CH EN Long -sheng ,LEI Q-i fu(College o f Chemistry and Chem ical Engineer ing ,Central South University ,Changsha 410083,China)Abstract:Using cellulase,a new technology of extracting r esv er atro l from Polygonum cusp idatum Sieb.et Zucc.w as developed.T he crude pow der o f P.cusp idatum was treated by means of cellulase before ex traction by reflux ing w ith ethanol.T he enzyme -based extr action technolog y was charact erized by its hig h extr action yield and gentle extraction conditions,which were determined ex perimently as follo ws:ex tract ion temper ature 50 ,pH value of ext raction me -dia 5.0,ex traction time 90min and mass r atio of enzyme to P.cusp idatum 1 pared w ith tr aditional extr act -ing technology by ethenol,ex traction yield of resveratrol was increased by about 5times by using this enzy me -based ex tractio n techno logy.Key words:cellulase;enzyme tr eatment;resveratrol;Polygonum cusp idatum Sieb.et Zucc.虎杖(Polygonum cusp idatum Sieb.et Zucc.)系蓼科属多年生草本植物,其根茎和根的药效收载于 中国药典 2000年版一部,具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰的作用[1]。

虎杖中主要含蒽醌类和芪类化合物,其中芪类成分白藜芦醇具有重要的生理活性[2~4]。

研究证明,白藜芦醇具有抗菌、抗癌、抗炎、抗过敏、降血脂和抗氧化等多方面的药理活性,是目前研究较热门而有希望的抗癌药剂之一[5~7]。

白藜芦醇在虎杖中主要以苷的形式存在,因此,作者考虑将白藜芦醇苷转化成白藜芦醇苷元,这将大大提高白藜芦醇的得率。

近年来,纤维素酶在国外广泛应用于各个领域,在国内将其应用于中草药提取尚处于起步阶段[8~10]。

大部分中药材的有效成分都被包裹在植物细胞壁内,细胞壁是由纤维素构收稿日期:2004-02-23作者简介:向海艳(1974-),女,湖南龙山人,博士生,主要从事天然产物活性成分的提取与分离研究*通讯联系人:周春山,博士生导师;E -mail:x hy -csu@ 。

第24卷第4期2004年12月林 产 化 学 与 工 业Chemistry and Industry of Forest ProductsVol.24No.4Dec.2004成,而纤维素则是由 -葡萄糖以1,4- -D -葡萄糖苷键连接,纤维素酶可以破坏 -D -葡萄糖苷键,从而提高有效成分的提取率。

而白藜芦醇苷是白藜芦醇以1,4- -葡萄糖苷键连接一个 -D -葡萄糖构成的,纤维素酶解作用将使白藜芦醇苷失去葡萄糖降解生成白藜芦醇苷元,从而提高白藜芦醇的提取率。

基于以上原理,本研究将纤维素酶用于虎杖中白藜芦醇的提取中,为白藜芦醇的提取提供一种新的方法,并为纤维素酶在中药有效成分提取中的应用提供依据。

1 实验部分1.1 仪器、试剂与药品DSY -1-2孔恒温水浴锅,北京东震科学仪器厂;BT 8100高效液相色谱仪;BT 8200UV 检测仪。

纤维素酶粗品(活力单位约1000U/g)为岳阳尤特尔生化有限公司提供;白藜芦醇(纯度>98%)对照品购自美国Sigma 公司;虎杖购自湖南省九芝堂药材公司,经鉴定符合中国药典(2000年版一部)虎杖中有关规定[1];色谱分析用甲醇为色谱纯,其余试剂为分析纯。

1.2 提取方法称取5.000g 虎杖粗粉,加入纤维素酶、水,在不同pH 值、不同温度下酶解一定的时间,然后加入一定量的提取剂,升温至提取温度,恒温提取一段时间。

减压抽滤,离心去沉淀,取上清液,测白藜芦醇得率。

图1 标准品(A)及样品(B)的HPLC 色谱图Fig.1 HP LC chromatograms of resveratrolstandar d(A )and sample(B)1.3 虎杖白藜芦醇含量测定方法1.3.1 色谱条件 色谱柱ODS -C 18(200m m 4.6mm,5 m );流动相:甲醇-水(体积比41 59);流速:0.6mL/min;检测波长303nm;柱温为室温。

该色谱条件下的白藜芦醇标准品及提取液样品的色谱图见图1。

1.3.2 标准曲线的绘制 精密称取白藜芦醇2.5mg 于25mL 容量瓶中,甲醇溶解并稀释至刻度,得每毫升含白藜芦醇0.10mg 的对照品储备液,备用。

精密吸取标准品储备液1.5、2.0、2.5、3.0和3.5mL,分别置于25mL 容量瓶中,甲醇稀释至刻度,制成不同浓度的标准品溶液。

依次取6 L 混合标准品溶液进样,每个浓度重复3次。

按上述色谱条件测定,绘制出标准曲线(图略),并计算回归方程。

结果表明,白藜芦醇在0.036~0.360 g 范围内呈良好的线性关系。

其线性回归方程及相关系数为:Y =3618260X -83481.6 r =0.9998式中,Y 峰面积积分值;X 标准品进样量, g 。

1.3.3 精密度实验 在上述色谱条件下,精密吸取白藜芦醇标准品溶液6 L,重复进样5次,测白藜芦醇含量,白藜芦醇含量的相对标准偏差(RSD)为0.82%。

1.3.4 稳定性实验 对同一供试品溶液在8h 之内每隔1h 测定峰面积,实验结果表明,白藜芦醇色谱峰面积无明显变化,其峰面积积分值的RSD 为1.2%,表明样品稳定性好。

1.3.5 加样回收率实验 取已知含量的同一批样品共5份,每份1g,精密称定。

分别精密加入白藜芦醇标准品溶液,按1.3节操作制备供试品溶液,并将所得的5份供试品溶液按1.3.1节进行测定,计算回收率,结果见表1。

78 林 产 化 学 与 工 业第24卷表1 回收率实验T able 1 Recov er y experiment序号No.白藜芦醇含量/mg content of resveratrol加入量/mg added amount测得值/mg tested amount回收率/%recovery1 3.0000 3.0002 3.0000.500 3.508101.63 3.000 1.000 3.99199.14 3.000 1.500 4.522101.55 3.000 2.000 4.99699.863.0002.5005.5614102.51.3.6 虎杖提取物中白藜芦醇含量测定 精密吸取1.2节所得上清液1.0mL 于50mL 容量瓶中,甲醇稀释至刻度,用微膜过滤即为供试液。

样品供试液按与标准曲线相同的色谱条件进样,每次进样6 L,重复3次,根据线性回归方程计算样品中白藜芦醇的得率。

白藜芦醇得率(%)=白藜芦醇质量/虎杖粗粉质量 1002 结果与讨论2.1 酶用量的影响在50 、pH 值5.0条件下,考察提取介质中酶用量对提取的影响,以确定最佳的酶与底物的配比,结果如图2(a)所示。

当每50mL H 2O 中虎杖用量为5.000g 时,提取介质中纤维素酶用量增加到10mg 后,再继续增加酶用量,白藜芦醇得率增加的幅度不大,因此,较适宜的酶用量为10mg,即纤维素酶与虎杖粗粉之间适宜配比为1 500。

2.2 酶解温度的影响在pH 值5.0、不同温度下、酶解90min,酶解后加入一定量提取剂,并升温至60 ,提取120min,结果如图2(b)所示。

由图2(b)可知,当酶解温度50 时,白藜芦醇得率最高,这是由于温度若高于50 ,酶蛋白就开始受热变性,从而影响其活性。

2.3 pH 值的影响在50 、不同pH 值条件下,酶解90min,酶解后加入一定量提取剂,升温至60 ,提取120min,结果如图2(c)所示。

从图2(c)可见,纤维素酶在pH 值5.0处提取效果最好,这是由于酶对pH 值比较敏感,只在很小的范围内起作用,pH 值的改变可以破坏酶空间构象,引起酶活性的损失。

2.4 酶解时间的影响在50 、pH 值5.0时,酶解不同的时间,然后加入一定量的提取剂,升温至60 ,恒温提取120min,结果如图2(d)所示。

从图2(d)可见,酶解时间90min,酶解已基本完全,再延长时间,白藜芦醇得率提高缓慢。

图2 不同提取条件对白藜芦醇提取率的影响Fig.2 Effects of different ext racting conditions on r esver atro l yield2.5 直接醇提法与酶法醇提取效果比较采用两种方法进行提取,结果如表2所示。

从表2可见,用纤维素酶酶解后提取,其白藜芦醇得率比直接醇提法提高了近5倍。

这是由于纤维素酶可充分破坏虎杖以纤维素为主的细胞壁结构,使被包裹在内的有效成分白藜芦醇易于溶出。