方法
2.3。5 细菌的生理生化鉴定
１、形态学观察
采用插片法、埋片法, 对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。用革兰氏染色进行油镜观察。
① 革兰氏染色
溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95％乙醇，番红复染液等.
试验步骤：（1) 涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干燥和固定。
(2) 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出水无色。
（3）媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，水洗至流出水无色。
(4）脱色：在上述涂片上流加95％乙醇溶液（一般20~30s）,当脱色至流出液无色时立即用水洗去乙醇。
（5）复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min,水洗,用吸水纸吸去残水晾干。
(6）镜检：用油镜观察。
②芽孢染色
（1）制片:按常规方法涂片、干燥及固定。
（2）加热染色：向载玻片滴加数滴5％孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５min,加热时应注意补充染液，切勿让涂片干涸.
脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色.
(3）复染：用0.5％番红水溶液复染2min。
(4) 水洗:用缓流自来水冲洗至无色。
(5) 镜检：晾干载玻片后油镜镜检。
③鞭毛染色(硝酸银染色法）
(1) 载玻片准备:将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸 20min，然后用清水充分洗净,再置于 95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。
(2) 菌液制备：用接种环挑取菌落边缘菌体，悬浮于1～2mL无菌水中制成菌悬液，不能剧烈震荡。
（3) 制片:取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，倾斜玻片,使菌悬液流向另一边,用吸水纸吸取多余的菌悬液,自然干燥。
（4）染色：滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色,鞭毛显褐色。
（5）镜检：用油镜镜检观察。
A、B液需现用现配（4h内效果最佳，1d内可用):
A：单宁酸5ｇ,三氯化铁1.5ｇ，蒸馏水100mL，加1%氢氧化钠1mL，15％甲醛2mL.
B：硝酸银粉末2ｇ,水100mL，溶解匀均，取出10mL回滴用,往90mL溶液中加浓氨水到出现大量沉淀时再加浓氨水至溶液澄清。加10mL回滴液回滴至出现薄雾。
２、糖类分解试验
配方：蛋白胨 1。0ｇ；NaCl 0。5ｇ；0。2％溴百里香酚兰 1。2mL;葡萄糖 1.0ｇ；蒸馏水 100mL。
基本原理：糖类分解实验是常用的鉴别微生物的生化反应，鉴定细菌能否利用分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氨气、甲烷、二氧化碳等)。当发酵产酸是，指示剂可有紫色(pH6。8)转变为黄色（pH5。2).气体的产生可由倒置的小管中有无气泡来证明。
试验步骤:用记号笔在试管外面分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌的编号。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管，按编号接种细菌，每种细菌做两个平行,可留一个空白，作为对照。在接种后要轻摇试管，防止倒置的小试管进入气泡.再将将上述已接种的和对照管置37℃温室中培
养2～3d 。观察颜色变化及小试管中有无气泡。
３、V —P 试验
配方：蛋白胨 1.5g ；葡萄糖 1。5g;K 2HPO 4 1。5g ；蒸馏水300mL ；pH ：7。4
基本原理：此实验也是常用的检验细菌的生化反应之一。某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境再被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基生成红色化合物，称V —P 反应。
试验步骤：将被检菌接种于试验培养基中，培养2～7d 后，于培养物中加入1mL 10％ 的NaOH ，混匀，再加入3～4滴2% 氯化铁溶液.数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性.
４、甲基红试验
配方：与V-P 试验的配方相同
基本原理：某些细菌在糖代谢过程中，会分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸还可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH 将至4。5以下，当加入甲基红试剂则呈红色,为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量小，或者产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍会在pH6。2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色,为阴性。 试验步骤:接种细菌于培养基，在37℃培养2~7d 后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0。1ｇ甲基经溶于300mL 95% 乙醇中,加蒸馏水至500 mL),如呈红色,表示阳性.
５、柠檬酸盐利用试验
配方：柠檬酸钠1ｇ;硫酸镁 0.2ｇ;NaCl 5ｇ；NH 4H 2PO 4 1ｇ;K 2HPO 4 1ｇ;琼脂 20ｇ；1%溴麝香草酚蓝酒精溶液 10mL ；蒸馏水 1000mL 。
基本原理：柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐能否被利用。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，是培养基的pH 升高，当加入1％溴麝香草酚蓝指示剂时,培养基就会有绿色转变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH 小于6。0时呈黄色，pH 在6。5～7.0时为绿色，pH 大于7.6时呈蓝色。
试验步骤：将被检菌接种到Simmons 固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2～4d ，能利用柠檬酸
盐的细菌表现为有细菌生长,培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。
６、硝酸盐还原试验
配方：硝酸钾 0。2ｇ；蛋白胨 5ｇ;蒸馏水1000mL；pH:7。4。
甲液：４-苯胺磺酸(对氨基苯磺酸） 0.4ｇ；5mol/L冰醋酸 50mL。
乙液：α—萘胺 0。25ｇ;5mol/L冰醋酸 50mL.
基本原理：某些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐,亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的４-苯胺磺酸作用生成重氮基苯磺酸,后者与α-萘胺结合生成N—α萘胺偶苯磺酸。
试验步骤:将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1~2d，每管中先加入甲试剂0.1mL，再加乙试剂数滴,如出现红色，表示阳性。
注：本试验阴性的原因有三:细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。
７、淀粉水解试验
配方：牛肉膏 0。5ｇ；蛋白胨 1ｇ;氯化钠 0。5ｇ；可溶性淀粉 0。2ｇ；蒸馏水 100mL;琼脂 2ｇ;pH：7.0～7.2。
基本原理:有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色.
试验步骤:将细菌划线接种于平板上，37℃左右培养1～2d,生长后取出,在菌落处滴加革兰氏碘液少许,能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环，培养基会呈深蓝色。
８、吲哚（靛基质）试验
配方:蛋白胨 1ｇ；NaCl 0.5ｇ；蒸馏水 1000mL；pH:7.6。
吲哚试剂自行配制：对二甲基氨基苯甲醛 0。5g；乙醇(95%） 47。5mL；浓盐酸 10mL.
基本原理：有些细菌可以产生色氨酸酶,分解色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与二甲基氨基苯甲醛反应生成红色的玫瑰吲哚，因此可根据细菌能否分解色氨酸产生吲哚来鉴定菌种.
