下载文档原格式
《生物分离工程》课程笔记第一章绪论一、生物分离工程的历史及应用1. 历史生物分离工程的历史可以追溯到古代酿酒和面包制作时期，但作为一个独立领域的发展始于20世纪。
早期的生物分离技术主要依靠自然现象，如沉淀、结晶等。
随着科技的发展，尤其是生物技术的崛起，生物分离工程逐渐形成一门独立的学科，并得到了迅速发展。
2. 应用生物分离技术在医药、食品、农业、环境保护等领域有广泛的应用。
例如，在疫苗生产中，需要从细胞培养液中分离出病毒或细菌；在抗生素提取中，需要从发酵液中提取抗生素；在蛋白质纯化中，需要从混合蛋白质中分离出目标蛋白质；在果汁澄清中，需要去除果汁中的悬浮固体等。
二、生物分离过程的特点1. 复杂性生物分离过程涉及生物大分子（如蛋白质、核酸、多糖等）的分离和纯化，这些生物大分子在结构和性质上具有很高的复杂性，因此生物分离过程也具有较高的复杂性。
2. 多样性生物分离过程中，针对不同的生物大分子和混合物，需要采用不同的分离方法和工艺，因此生物分离过程具有很高的多样性。
3. 灵敏度生物大分子在分离过程中容易受到外界因素的影响，如温度、pH值、离子强度等，因此生物分离过程需要严格控制条件，具有很高的灵敏度。
4. 易失活性生物大分子在分离过程中容易发生变性、降解等失活现象，因此生物分离过程需要尽量减少这些失活现象的发生。
5. 高价值生物大分子往往具有很高的经济价值，如药物、生物制品等，因此生物分离过程需要高效、高收率地分离目标物质，以满足市场需求。
第二章过滤一、过滤基本概念及预处理1. 过滤基本概念过滤是一种基于孔径大小实现固体与流体分离的技术。
在生物分离工程中，过滤技术被广泛应用于细胞培养液、发酵液、酶反应液等混合物的初步分离和纯化。
过滤过程中，混合物通过过滤介质（如滤纸、滤膜等），固体颗粒被拦截在过滤介质上，而流体则通过过滤介质流出，从而实现分离。
2. 预处理为了提高过滤效率，通常需要对混合物进行预处理。
生物工程下游技术知识要点（总复习）第三章发酵液预处理与固液分离 1.加水稀释法（稀释后要过滤速率提高的百分比要大于加水量）1.降低液体黏度2.加热法2.调整PH （如利用蛋白质的等电点）3.凝聚：在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。
过滤特性改变凝聚值越小，凝聚能力就越强絮凝：在有些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。
混凝：包括上述两种方法。
4.加入助滤剂（最常见的是硅藻土）5.加入反应剂1. Ca 2+ : 加草酸钠除杂 Mg 2+ :加三聚磷酸钠C a 2+：加黄血盐1.沉淀法2.杂蛋白的除去： 2.变性法（有加热法，调PH ，加酒精，丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。
）3.吸附法 (加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白而除去)1.离心公式：Q=v ω2Z g d v L S ?-=μρρ18)(2 固液分离手段θπctg r r gn Z )(323132-=2.过滤（1）板框过滤机（适合固体含量在１％—１０％的悬浮液的分离）（２）真空转鼓过滤机（适合固体含量大于１０％）（３）硅藻土过滤机（适合固体含量小于０．１％）第五章细胞破壁细胞破壁１．破壁方法：（１）珠磨法原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠，石英砂，氧化铝等研磨剂一起快速搅拌或研磨，研磨剂，珠子与细胞之间的互相剪切，碰撞，使细胞破碎。
（2 ）高压匀浆法原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。
是大规模细胞破碎的常用方法。
（3）超声破碎法（适合实验室用）（4 ）酶溶法 1 .外加酶法2. 自溶法（1）加热法（2）干燥法（5）化学渗透法2.破碎率的测定（1）直接测定法破碎前利用显微镜计数器直接计数破碎后用染色的方法把破碎的细胞与未受损的细胞分开。
即可直接计算破碎率。
（2）目的产物测定法通过测定破碎液中目的产物的释放量来估算破碎率。
生物分离工程复习笔记生物分离工程内容：1.生物分离工程概念、特点、操作流程等；2.生物分离中常用到的分离操作方法，其概念、原理、特征、适用对象、注意事项、优缺点、使用实例等；3.常用方法的比较；基本知识点（一）一．生物分离工程概述1，生物分离工程（P1）生物分离工程是指从发酵液、反应液或动植物细胞培养液中分离、纯化生物产品的过程。
它描述了生物产品分离、纯化过程的原理、方法和设备，又称为生物工程下游技术。
特征：应用面广;种类繁多，结构功能复杂，生物活性各异;目的产物在初始物料中的含量低;原料中目标产物浓度越低，所需能耗越高，分离过程成本越大;始物料成分复杂,常需多个步骤,产品总收率低;易变质、易失活、易变性，对温度、pH值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感；产品的质量要求高，尤其是药品等2.传统生化产品和基因工程产品在提取和精制上的差异（P1）（了解）1）传统生化产品都为小分子(工业用酶除外，但它们对纯度要求不高、提取方法较简单)．其理化性能(如平衡关系等)数据都为已知，因此放大比较有根据；基因工程产品大多为大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。
2）由于第一代基因工程产品都以E.coli作为宿主，表达产品处于胞内，提取前需将细胞破碎，细胞内物质释放出来，给提取增加了很多困难；而发酵液中的产物，浓度较低，杂质又多，且一般大分子较小分子不稳定(易失活，如对剪切力)，故提取较困难。
3）大分子(蛋白质)的分离主要困难在于杂蛋白的分离，由于蛋白质都内氨基酸所构成，所以性质相似，分离主要依靠高分辨力的精制方法，如色谱分离等。
3.生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作（P4）1）一般工艺流程一般来说，下游加工过程含培养液（发酵液）的预处理和固液分离；初步纯化（提取）；高度纯化（精制）；最后纯化。
第1 页共1 页生物分离工程2）具体过程1发酵液预处理和固液分离○过滤和离心是预处理最基本的单元操作。
第一章膜分离技术1.1基本概念1.1.1膜（membrane）是什么？膜，是指在一种流体相内或是在两种流体相之间有一层薄的凝聚相，它把流体相分隔为互不相通的两部分，并能使这两部分之间产生传质作用。
1.1.2特性：1)不管膜多薄，它必须有两个界面。
这两个界面分别与两侧的液体相接触。
2)膜传质有选择性，它可以使流体相中的一种或几种物质透过，而不允许其他物质透过。
1.1.3膜分离过程的原理以选择性膜为分离介质，通过在膜两边施加一个推动力（如浓度差、压力差或电位差等）时，使原料侧组分选择性地透过膜，以达到分离提纯的目的。
通常膜原料侧称为膜上游，透过侧称为膜下游。
1.1.4膜分离的特点1)操作在常温下进行；2)能耗较低3)在很多情况下选择性较高；4)浓缩和纯化可在一个步骤内完成；5)设备易放大，可以分批或连续操作；1.1.5膜的分类1)按孔径大小：微滤膜、超滤膜、反渗透膜、纳滤膜2)按膜结构：多孔膜、致密膜、液膜：前者微滤膜、超滤膜、纳滤膜，中者反渗透膜、渗透蒸发3)按材料分：合成有机聚合物膜、无机材料膜4)按截留分子量：微滤（0.02-10um）、超滤（50-100nm）、纳滤（1nm）、反渗透膜（200Dalton）1.1.6膜分离过程的主要推动力1.2膜分离的理论基础1.2.1膜分离的实质1)溶解速率：与膜表面接触的溶质进入膜内的速率2)扩散速率：溶质进入膜后从膜的一侧到达另一侧的速率1.2.2物质透过膜的方式：被动传递、促进传递、主动传递1)被动传递：物质由高化学位相向低化学位相传递，这一化学位差就是膜分离的推动力2)促进传递：膜内有载体，在高化学位一侧，载体同被传递的物质发生反应，而在低化学位一侧又将被传递的物质释放，这种传递过程有很高的选择性。
3)主动传递：膜中的载体同被传递物质在低化学位侧发生反应并释放能量，使被传递物质由低化学位一侧被传递到高化学位一侧，物质的传递方向为逆化学位梯度方向。
推动力：压力差、浓度差、电位差、温度差1.2.3截留率膜对溶质的截留能力以截留率R表示R＝1－Cp／Cr式中Cp和Cr分别表示透过液（Permeate）和截留液（Retentate）的浓度。
生物分离技术一、概述1、生物分离技术的基础：生物化学、微生物学、动物、植物细胞工程。
生物分离技术的定位：下游——分离、纯化。
（上游：选菌、DNA重组、蛋白质改造；中游：发酵、表达、固化技术）在传统发酵投资中占60%，在DNA和蛋白质精制中占80-90%。
2、发展历史：第一阶段：1950年以前的纯培养技术，以压滤、蒸馏为主。
第二阶段：1950通气培养技术和代谢控制技术（离子交换和电泳）第三阶段：21世纪，现代生物技术；生物分离工程。
3、分离技术及应用范围：•沉淀分离：盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性沉淀、非离子聚合物沉淀（PEP）•层析分离：吸附、凝胶、离子交换、疏水、反相、层析、聚焦层析和亲和等•电泳分离：SDS-PAGE、等电聚焦、2D-电泳、毛细管电泳•离心分离：低速、高速、超速•膜分离：透析、微滤、超滤、纳滤、反渗透•萃取技术（双水相萃取、超临界流体萃取、反胶束萃取）、液膜分离、泡沫分离、结晶技术等。
4、生化分离技术的特点：成分复杂、含量极微、易变性、易破坏、具有经验性和均一性；易变性主要体现在过酸、过碱、高温、高压、离子强度和重金属离子，较低的温度和洁净的环境才下进行。
生化分离方法多采用温和“多阶式”进行，“多层剥皮”的方法，现在有一种新技术“钓鱼法”，利用的是某些分子的特有的专一亲和．．力。
易破坏：氧化、水解、微生物污染。
由于品种多、难度大，导致成本高，所以需要考虑：产品价格；质量标准；产品与杂质的物化区别；产品流经途径是否合理；不同的分离技术方案经济指标的比较。
主要原理是用机械方法或者混合物外加一定的作用力，使各组分分配到不同的物相中。
5、生化分离的基本步骤：1）建立分析方法：生化分离过程一旦展开，都应首先建立快速灵敏的分析方法，以保证分离工作的顺利进行，利用生物测定、理化测定或两者的结合。
测定方法必须满足特异性、重现性好、准确度高、灵敏度高、时间短。
2）选择提取材料：原则是材料来源丰富、含量高（要考虑收率）、杂质少、成本低；范围包括动物植物微生物。
第一章沉淀分离技术1.1沉淀的目的1)通过沉淀达到浓缩的目的。
2)通过沉淀、固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分3)沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理1.2沉淀法的概念沉淀法是指采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分呢和其他成分分开的技术。
1.3沉淀法操作步骤1)加入沉淀剂2)沉淀剂的陈化促进粒子的生长3)离心或过滤、收集沉淀物PS：陈化是指将有沉淀的溶液静置,使沉淀中的分子等有归律的排列,并排列紧密,还有使沉淀聚沉,颗粒变大1.4沉淀过程应当考虑的问题1)沉淀能否发生2)沉淀剂或沉淀条件下对活性结构是否有破坏作用3)沉淀剂是否容易除去4)沉淀剂是否对人体有害1.5蛋白质的分离提取1.5.1优缺点优点：设备简单，成本低，原材料易得，便于小批量生产缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品纯度常比结晶法低，过滤也较困难。
1.5.2沉淀法分离蛋白质的特点1)生产前期可使原料液体体积很快减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；2)使中间产物保持在一个中性温和的环境；3)可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；4)用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。
1.5.3蛋白质的溶解特性1)蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。
2)蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。
3)一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。
1.5.4蛋白质胶体溶液的稳定性1.5.4.1防止蛋白质凝聚沉淀的屏障1)水化层：蛋白质周围的水化层可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液2)电荷：蛋白质分子间的静电排斥作用1.5.4.2颗粒间的相互作用1)蛋白质分子间的静电斥力2)范德华力1.6蛋白质的沉淀方法1)中性盐盐析法2)等电点沉淀法3)有机溶剂沉淀法4)非离子型聚合物沉淀法5)聚电解质沉淀法6)金属沉淀法等1.6.1中性盐沉淀法1.6.1.1概念在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。
1.6.1.2基本原理蛋白质和酶均易溶于水，分子中的－COOH、－NH2和－OH等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。
1.6.1.3优缺点优点：成本低；操作简单、安全；对许多生物活性物质具有稳定性缺点：所得产品进一步纯化前需要脱盐1.6.1.4盐溶和盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶；当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析.1.6.1.5中性盐的选择1)盐析作用要强2)盐析用盐需有较大的溶解度3)盐析用盐必须是惰性的4)来源丰富、经济1.6.1.6常用的盐：硫酸铵优点：溶解度大；分离效果好；不易引起变形，有稳定酶与蛋白质结构的作用；价格便宜，废液不污染环境。
缺点：缓冲能力弱，有腐蚀性，含N1.6.1.7盐析的操作方法1)加固体盐法2)加饱和溶液法3)透析平衡法1.6.1.8盐析曲线的制作1.6.1.9盐析的影响因素1)离子强度与离子类型磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁2)蛋白质的浓度3)pH的影响蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。
改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。
远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近4)温度的影响对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大。
对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。
在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的。
1.6.1.10注意事项1)注意饱和度表中规定的温度；2)盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心；3)加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓；4)高浓度的硫酸铵溶液使用前需用氨水或硫酸调节至所需pH。
1.6.2等电点沉淀法1.6.2.1基本原理蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性，依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。
1.6.3有机溶剂沉淀法1.6.3.1机理分析进展1)加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀。
2)蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取代，从而降低了它们的溶解度。
3)有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。
1.6.3.2优缺点优点：分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀；沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。
缺点：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。
成本高。
1.6.3.3有机溶剂沉淀的影响因素1.6.4非离子多聚沉淀法20世纪60年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使用，如：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖等。
1.6.4.1基本原理1)沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。
2)由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。
3)聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。
4)通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。
1.6.4.2特点（优缺点）1)操作条件温和，不易引起生物大分子变性2)沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子3)沉淀后有机聚合物比较难以去除1.6.4.3方法1)选用两种水溶性非离子多聚物组成液液两相体系，不等量分配，而造成分离。
2)选用一种水溶性非离子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。
1.6.5聚电解质沉淀法聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物，可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。
1.6.5.1基本原理蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多分子络合物，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，就发生沉淀。
1.7核酸的沉淀方法核酸分离纯化应维持在0-4℃的低温条件下，以防止核酸的变性和降解。
为防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羟基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶的活性。
1)有机溶剂沉淀法2)等电点沉淀法3)钙盐沉淀法4)溶剂沉淀法1.7.1有机溶剂沉淀法由于核酸都不溶于有机溶剂，所以可在核酸提取液中加入乙醇、异丙醇或2-乙氧基乙醇，使DNA或RNA沉淀下来。
1.7.1.1核酸沉淀的形状与其相对分子质量密切相关：1)相对分子质量>106Da的双链DNA可以丝状纤维缠绕在玻棒上；2)相对分子质量稍小的双链DNA或单链DNA、RNA则以凝胶形式存在。
3)这些核酸经离心后存在于沉淀中，用70%乙醇洗涤，除去其它盐和小分子物质，干燥后即为核酸制品。
1.7.2等电点沉淀法1)脱氧核糖核蛋白的等电点为pH 4.2；2)核糖核蛋白的等电点为pH 2.0-2.5；3)tRNA的等电点为pH 5。
1.7.3钙盐沉淀法1.7.4选择性溶剂沉淀法1)在核酸提取液中加入氯仿/异戊醇或氯仿/辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿/水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。
2)在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都进入水层，而蛋白质沉淀于苯酚层中被分离除去。
3)在DNA与RNA的混合液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA而与留在溶液中的RNA分离。
1.8讨论和作业1.8.1四环素的提取原理及过程基本原理：1)四环素由链丝菌发酵获得2)四环素等电点pI=5。
当溶液的pH 等于等电点时，四环素易从水溶液中沉淀出来（游离碱），因此可用于四环素的提取。
3)四环素又能与尿素形成1：1的复盐，从水溶液中沉淀出来，该复盐溶于有机溶剂时，即分解成四环素和尿素。
4)四环素与尿素的这一反应具有特异性：金霉素，土霉素都不能与尿素形成复合物沉淀。
利用这一性质，可精制四环素。
过程：1)预处理发酵液；过滤（加草酸酸化至PH1.7-1.8，分别加0.2％(w/v)黄血盐、硫酸锌）；滤渣和滤液；2)第一步沉淀提取滤液（7000-9000u/ml）；搅拌下慢慢加入浓氨水调pH4.810-15℃，滤液搅拌30min，过滤；沉淀粗碱3)第二步沉淀提取粗碱；溶于尿素盐酸溶液中（粗碱干重: 尿素: 水: 浓HCl1:2:2:0.25）；粗碱尿素溶液；浓氨水调pH4.6～4.8搅拌20min，过滤；四环素尿素复盐沉淀；溶于酸性丁醇中复盐干重:丁醇:浓HCl＝1:10:0.3 (丁醇先，搅拌下滴加HCl)；丁醇悬浮液溶液，丁醇清液；结晶。
