《固定化酶》PPT课件 (2)

包埋法
网格法 微囊法
化学结合法
交联法 共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
• 是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
• 选择载体的原则
①要有巨大的比表面积
② 要有活泼的表面 ③ 便于装柱进行连续反应。
常用的载体有：
• (1)有机载体： • 纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。
第三章
酶的固定化
• 第一节 酶的固定化 • 第二节 辅酶的固定方法 • 第三节 固定化细胞 • 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 • 第五节 固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
• 绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
• 特点:
它的机械强度高，在包埋的同时使酶共价偶联到 高聚物上。
缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚。调 整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。
• 海藻酸钠
它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al 3+凝胶化 ，操作简单经济。
• K-角叉莱胶（卡拉胶）
• 卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又称鹿角菜；Cawageen)中提取的一种多糖。
可以冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。 包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化 的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好 。
(2)微囊化包埋法
➢微囊法主要将酶封装在半透性聚合物膜的微 囊中（如胶囊、脂质体和中空纤维）。
➢胶囊和脂质体主要用于医学治疗； 中空纤维主要适于工业使用 。
➢主要包括
（1）界面沉淀法 （2）界面聚合法 （3）脂质体包埋法
• 离子交换剂的吸附容量一般大于物 理吸附剂。
• ⑴阴离子交换剂：
二乙基氨基乙基(DEAE)—纤维素、混合胺类(ECTEDLA)纤维素、四乙氨基乙基 (TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝 胶、Amberlite IRA-93、410、900等。
• ⑵阳离子交换剂：
羧甲基(CM)—纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50 、IRC—50、IR—200、 Dowex-50等。
慢得多。 6. 载体：非多孔性载体---颗粒越小吸附力越强。多孔
性载体--要考虑酶的大小和吸附面积的大小。
3、包埋法
包埋法是将酶物 理包埋在高聚物网 格内的固定化方法 。
如将聚合物的单体和酶溶 液混合后，再借助聚合促 进剂的作用进行聚合，将 酶包埋于聚合物中以达到 固定化的目的。
• 包括凝胶包埋和微囊化 包埋两种。
界面沉淀法
物理微囊化法。它是利用某些高聚物在水相和有机 相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。此
法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很 麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基 丙烯酸甲酯等。
界面聚合法
化学方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合 ，形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。所得的 微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程 中发生化学反应而失活。
• ②工厂初始投资大
• (3)有利于工艺自动化和微电脑化 • ③只能用于可溶性底物 ，对大分子底物不适宜
• (4)多次使用 • ④与完整菌体相比，需
• (5)较游离酶相比能适应于多酶反应 要辅助因子的催化反应
• (6)产品质量高，成本低
不适宜于多酶反应
固定化酶的制备原则
• ①必须注意维持酶的催化活性及专一性。 • ②固定化的载体必须有一定的机械强度
即能通过简单的过滤或离心就可回收和重 复使用。
• ⑦固定化酶成本要低，以利于工业
使用。
• ⑧充分考虑到固定化酶制备过程 和应用过程中的安全因素。
固定化载体的选择标准
① 载体的形式 ② 载体的结构 ③ 载体的性质 ④ 酶偶联量或装载量和实效系数
二、固定化酶的制备方法
非化学结合法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法
• 解决办法??
第一节 酶的固定化
• 一、固定化酶（Immobilized Enzyme）
• 定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的 酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收 重复使用。
固定化酶的优缺点
• 固定化酶优点：
• 固定化酶缺点：
• (1)简化了提纯工艺
• ①酶活力有损失
• (2)可以装塔连续反应
(1)凝胶包埋法：
• 将酶分子包埋在凝胶高聚物网格内的包埋 方法。
• 聚丙烯酰胺、海藻酸钠、K-角Байду номын сангаас菜胶（卡 拉胶）、胶原和明胶等
聚丙烯酰胺包埋
• 先把丙烯酰胺单体、交联剂（如N,N-甲叉双丙烯 酰胺）和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入 聚合催化剂（如二甲氨基丙腈与过硫酸钾）使之 开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚 物网络。
有利于生产自动化，连续化，不能因机械搅拌而破碎或脱 落。 • ③固定化酶应有最小的空间位阻
尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 • ④酶与载体必须结合牢固 能回收贮藏，反复使用。 • ⑤固定化酶应有最大的稳定性
所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。
固定化酶的制备原则
• ⑥固定化酶应容易与产物分离，
• 缺点：
酶与载体相互作用力弱导致酶易脱落。
吸附程度的影响因素:
1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附
2. 离子强度：一般认为盐阻止吸附。 3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，
吸附量也增加，直至饱和。 4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子
1969年，最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是 使用多糖类阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25固定化的。
吸附法特点
• 优点：
操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过 程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的 固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。酶
活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。
• (2)无机载体： • 氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。 • 无机载体的吸附容量较低，而且酶容易脱落。
2、离子结合法
(在工业上具广泛的用途)
• 将酶与含有离子交换基团的水不溶载体相结合而达到固 定化的一种方法。
• 在适宜的pH和离子强度条件下 ，利用酶的侧链解离基团和离 子交换基团间的相互作用而达 到酶固定化的方法。