可能的抽问

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1.碘量法中为什么选择37℃进行恒温水浴?

因为β-内酰胺酶的最适温度是40℃,在37℃活性也可以达到81.48%,但和它反应的青霉

素在40℃临界点易分解,折中选择37℃. 2.碘量法的原理:青霉素分解产生的青霉噻唑酸中2号碳上的H具有一定的活性,可表现一

定的还原性,可将I2还原成碘离子,在和25ML 0.01mol/l的碘溶液相比是少量的,反应所

剩下的碘则用硫代硫酸钠反应掉,淀粉最后加入是为了起指示剂作用,当第2部中的碘溶液

反应快无色时,加淀粉溶液,加最后一两滴硫代硫酸钠,溶液由蓝色变为无色,定量准确,

碘反应完。淀粉最好在最后一步加入,因为淀粉与碘反应形成的复合物是将碘包在支链中的,不利于反应进行,碘也不能在第一部加入,因为β-内酰胺酶易受溶液环境的影响,碘具有

强氧化性,使酶促反应不能正常进行,没有后续实验结果,出现假阳性(实验出现差错,但

现象与不含β-内酰胺酶一样)。

3.高效液相法中第一次离心取下清液,第二次离心取上清液的原因?

鲜牛奶离心后,最上层是乳脂,中间是乳清,第一次离心起到除杂、富集的作用。第二次添

加无水乙醇是为了沉淀乳清蛋白,避免干扰液相法检测只取上清液中未反应的青霉素钾和生

成的青霉噻唑酸。 4.用磷酸缓冲液(pH=8.0)淋洗萃取柱,用乙腈的原因?

在流动相洗脱过程中,是根据样品的极性不同,在流动相中溶解的浓度也不同,有的可以互

溶,有的不容,有的有一定溶解度。就可以根据这个物理原理分离。反应生成的青霉噻唑酸

是一种二羧酸,酸性较强,流动相中又选用了常用试剂甲醇,二者易反应生成青霉噻唑酸酯,

对液相测定不利,所以常用磷酸缓冲液(pH=8.0)中和酸。用乙腈作为溶剂蛋白沉淀剂,使测定物质准确定位成青霉素。

5.将一组实验组和对照组稀释的原因?

保证反应中的β-内酰胺酶是少量的,完全反应,生成的青霉噻唑酸也是少量的,能被碘完

全中和。

6.加甲醇的作用? 青霉素虽能形成水溶液,但稳定性差,加入甲醇形成酯,增强其稳定性,但修饰的位置并不

在2号碳上,不影响后续的测定。

7.流动相中用0.004M 磷酸二氢钾(pH=4.5)?

缓冲,使其出峰效果更好,无拖尾。