柑橘属品种鉴定 ssr分子标记法 编写说明

柑桔无核机理及无核性状分子标记研究的开题报告一、研究背景柑橘属于芸香科植物，是我国特产水果，也是全球广泛栽培的水果之一。

柑橘是世界上产量最高、最重要的柑果，其果实中的糖分丰富、含有大量的维生素和矿物质等成分，受到广泛的消费者欢迎。

但传统柑橘品种中，果核占据了相当大的比例，影响了其口感和食用价值。

因此，开展柑橘去核育种研究，具有重要的现实意义。

二、研究内容本研究主要从无核性状的形成机理和无核性状的分子标记两个方面展开研究。

1. 柑橘无核机理研究通过收集国内外文献，调查国内外柑橘无核栽培品种的形态特征和遗传特点等相关信息，了解其无核性状的形成机制和遗传规律。

利用柑橘生物学、遗传学等相关理论，结合实验结果，探究柑橘无核性状形成的病理生理机理。

2. 柑橘无核性状分子标记研究通过基因组学、遗传工程等组学技术，分离和鉴定柑橘无核性状基因，筛选与之相关的遗传标记；利用分子标记技术检测无核柑橘对应基因等遗传信息，建立与无核性状相关的分子标记图谱。

三、研究意义本研究的意义主要体现在以下几个方面：1. 通过理论研究，深入掌握柑橘无核性状形成机制，为无核柑橘培育和品种改良提供理论支撑。

2. 第一次建立柑橘无核性状分子标记图谱，为柑橘无核育种的分子标记辅助选择和育种进程提供支撑。

3. 奠定柑橘生物学、遗传学等基础研究的基础，为柑橘科学的发展做出贡献。

四、研究方法1. 收集参考文献、实地调查或收集国内外已知柑橘无核品种，进行性状描述、形态特征记录和验收鉴定。

2. 通过基因工程技术，利用T-DNA插入、RNAi、CRISPR/Cas9等方法进行基因敲除、转化、选择、筛选等操作，验证柑橘无核性状相关基因与无核性状的相关性。

3. 利用PCR、RFLP、SSR、SNP、AFLP等基因分型技术进行基因型分析，筛选柑橘无核性状相关基因的分子标记。

4. 分析以上实验数据，归纳总结柑橘无核性状的形成机理和有关分子标记信息，建立相关模型和分析算法。

《基于SSR标记的小豆品种鉴定体系建立及应用》篇一一、引言小豆作为我国重要的粮食作物之一，其品种繁多，品质差异大。

为了准确鉴定小豆品种，保障农业生产及市场流通的顺利进行，建立一套高效、准确的小豆品种鉴定体系显得尤为重要。

本文旨在介绍基于SSR（Simple Sequence Repeat）标记的小豆品种鉴定体系的建立及其应用。

二、SSR标记技术简介SSR标记，即简单重复序列标记，是一种基于DNA多态性的分子标记技术。

其优点在于操作简便、重复性好、信息量大等，因此在作物品种鉴定、遗传图谱构建等方面得到了广泛应用。

SSR标记通过分析特定基因座上的重复序列的变异情况，可实现作物品种的快速、准确鉴定。

三、小豆品种鉴定体系的建立1. 样品采集与DNA提取：从各地收集小豆品种样品，采用合适的DNA提取方法获取高质量的DNA。

2. SSR引物设计：根据小豆基因组信息，设计特异性高、多态性好的SSR引物。

3. PCR扩增及数据分析：以提取的DNA为模板，进行PCR 扩增，通过电泳、测序等方法获取SSR标记的基因型数据。

4. 品种鉴定模型的构建：利用统计软件对基因型数据进行处理，建立小豆品种鉴定模型。

四、小豆品种鉴定体系的应用1. 品种纯度鉴定：通过SSR标记技术，可快速鉴定小豆种子的纯度，为种子质量检测提供依据。

2. 品种资源保护：利用SSR标记技术对小豆种质资源进行鉴定，为种质资源的保护和利用提供支持。

3. 遗传育种研究：SSR标记技术可用于小豆遗传图谱的构建，为小豆遗传育种研究提供有力工具。

4. 农业执法与市场监管：通过SSR标记技术，可对市场上的小豆品种进行快速、准确的鉴定，为农业执法与市场监管提供支持。

五、结论本文建立了基于SSR标记的小豆品种鉴定体系，通过样品采集、DNA提取、SSR引物设计、PCR扩增及数据分析等步骤，成功构建了小豆品种鉴定模型。

该体系具有操作简便、重复性好、信息量大等优点，可广泛应用于小豆品种的纯度鉴定、资源保护、遗传育种研究以及农业执法与市场监管等领域。

基于cpInDel标记和cpSSR标记的柑橘属及近缘属植物亲缘关系杨程;龚桂芝;彭祝春;常珍珍;易璇;洪棋斌【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2022(55)16【摘要】【目的】通过对柑橘叶绿体基因组变异位点的研究,从胞质层面揭示柑橘类果树的遗传进化,为柑橘种质资源的收集、评价和利用提供参考。

【方法】以甜橙叶绿体高变区序列为参考,利用已发表的二代基因组测序数据对代表性的柑橘属及其近缘属材料进行De Novo组装,获得叶绿体基因组高变区组装序列,通过序列比对,发掘代表性材料的差异位点,针对差异位点设计cpInDel引物。

对甜橙叶绿体基因组两个及以上核苷酸重复构成的SSR位点进行定位分析,找出代表性材料间有差异的位点,针对差异位点设计cpSSR引物。

选择在分类学和/或起源研究上有代表性的柑橘属及近缘属材料48份,利用新开发的cpInDel、cpSSR标记和已报道的cpSSR标记进行扩增检测、电泳谱带分析和聚类分析。

【结果】本研究新开发4个cpInDel标记和13个cpSSR标记。

扩增检测显示,这些标记在48份试验材料中均能扩增出较为清晰的多态性条带;但cpInDel标记扩增出的条带更为单一,类群区分时,仅通过单个标记便能实现对某一类群或几个类群的区分,具有更好的区分效果。

聚类分析显示,cpInDel和cpSSR标记得到了比较类似的结果,但在小类群关系以及部分材料的归类上存在差异。

二者均揭示枸橼类柠檬-藜檬-来檬杂种的胞质来源并非香橼,枳杂种的胞质也并非枳,显示宽皮柑橘类黄柑的代表性品种‘旺苍皱皮柑’有不同于宽皮柑橘类其他品种的胞质来源,‘资阳香橙’和‘韩国香橙’胞质差异明显。

针对宽皮柑橘类、甜橙-酸橙类和宜昌橙-大翼橙类3个小类群的相互关系,cpInDel显示它们关系较近,而cpSSR则将它们归为独立的类群;cpInDel标记将印度野橘归于真正的枸橼类,cpSSR将其单独聚为一类。

【结论】叶绿体基因组分子标记分析能从胞质角度揭示不同于核基因组的柑橘属及近缘属植物的亲缘关系,但若与核基因组分子标记分析相结合,能更全面地揭示材料间的亲缘关系,更准确地鉴定柑橘种质资源。

柑橘EST-SSR分子标记分析(英文)江东;钟广炎;洪棋斌【期刊名称】《遗传学报：英文版》【年(卷),期】2006(33)4【摘要】对来源于甜橙(Citrus sinensis Osbeck)、枳壳(Poncirus trifoliata Raf.)和其他柑橘非冗余EST数据库的38 124条单一基因(Unigene)序列进行了简单重复序列SSRs(Simple Sequence Repeat)搜索,所分析的柑橘非冗余核酸序列总长23.29 Mb,从中获得了 8 218 条 SSR,其中包括单碱基重复 4 913 条(59.8%), 2 碱基重复 1 419 条(17.3%),3 碱基重复 1 709条(20.8%),4碱基重复114条(1.39%), 5碱基重复23条(0.28%), 6碱基重复40条(0.49%)。

大约每2.8kb 长度的单一基因序列中即存在1个SSR, 即平均4.6个单一基因中存在1个SSR。

随碱基重复单元(motif)的不同, SSR的最大长度在40–105之间,全部重复序列的平均长度为20.9 bp。

各种SSR (1-,2-,3-,4-,5-,6-核苷酸重复)的发生频率在甜橙和枳壳间非常接近。

其中单碱基重复序列是最丰富的重复单元,其次为3碱基重复。

在所得的SSR的重复单元中,富含A碱基的重复单元的分布占据优势地位,出现的频率与密度均较高,而富含CG碱基的重复单元出现频率和密度较低。

用25对EST-SSR引物对6个柑橘品种的多样性进行了PCR检测,结果表明,所有25对引物在6个柑橘品种间均扩增到多样性条带,证实通过柑橘EST数据库的发掘能够高效地筛选到基因水平的SSR标记。

【总页数】9页(P345-353)【关键词】柑橘;EST;微卫星;SSR【作者】江东;钟广炎;洪棋斌【作者单位】中国农业科学院柑橘研究所品种资源及育种研究室【正文语种】中文【中图分类】S666;S511.03【相关文献】1.交链格孢菌EST-SSR信息分析与分子标记通用性评价 [J], 丁换云; 魏迎凤; 陈小飞2.基于EST-SSR分子标记的狼毒大戟资源遗传多样性分析 [J], 姜明;马德志;周丽;刘振艳;陈晓婷;李慧3.菊苣EST-SSR分子标记开发及通用性分析 [J], 梁小玉;季杨;胡远彬;易军;白史且;张靓;张新全4.小麦EST-SSRs分子标记的特性及其遗传作图(英文) [J], 张立异;Leroy Philip;Bernard Michel;张庆勤;Sourdille Pierre5.NCBI和cDNA文库中栽培花生EST-SSR分子标记的开发及其特点(英文) [J], 王金彦;潘丽娟;杨庆利;禹山林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

SSR分子标记实验操作及其注意事项SSR(Simple Sequence Repeats ) 又称微卫星DNA，是一类由几个(多为1~6个) 碱基组成的基序(motif )串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于整个基因组的不同位置上，每个座位上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。

SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，而且分布均匀，多态性高，呈共显性遗传，重复性好，操作简便，是一种理想的分子标记技术，被广泛应用于构建基因连锁图分子辅助育种品种鉴定遗传资源的保存等方面。

一、试剂配制1.0.2%亲水binding silence（现配现用）：1500μL95%乙醇，7.5μL冰醋酸，再加入3μLbinding silence，混匀后使用。

2.0.5%疏水repel silence（购买后可直接使用）3.TBE母液（5×TBE）：Tris Base,54g;硼酸,7.5g;EDTA(0.5M pH8.0),20ml.搅拌溶化，定容至1000ml，无需灭菌，室温保存，母液的pH值应保持在8.3左右。

4.Urea－TBE(一块胶板用量)：5×TBE,12ml;尿素,27g.加双蒸水溶解后定容至51ml，使用漏斗过滤。

5.40％丙烯酰胺：丙烯酰胺,380g;甲叉双丙烯酰胺,20g.加热至37℃使之溶解，加水定容至1000ml，用醋酸纤维素滤膜（入Nalge滤器，0.45μm孔径）过滤，棕色瓶避光保存于室温。

6.10％APS（过硫酸铵）：超纯过硫酸铵,2g;超纯水,18ml.溶解后，4℃保存。

7.TEMED（购买后可直接使用）：电泳级的TEMED可购自Bio-Rad，Sigma或其他供应商。

8.Loading buffer：去离子甲酰胺,50ml;0.5MEDTA(pH8.0),1ml;二甲苯腈蓝cyanol,0.125g;溴酚蓝,0.125g.混匀后置于4℃保存。

果树学报2014，31（1）:1～6Journal of Fruit Science收稿日期：2013－06－04接受日期:2013－10－08基金项目：农业部行业科研专项“柑橘砧木资源收集、评价与筛选”（201203075）；国家863计划课题（2011AA100205）；教育部创新团队发展计划（IRT13065）作者简介：梁武军，男，在读硕士生，研究方向：生物技术与种质评价利用。

Tel:131********，E-mail:1833773487@觹通信作者Author for correspondence．Tel:027-********，E-mail:guoww@10个柑橘砧木类型同源四倍体的发掘与SSR 鉴定梁武军，解凯东，郭大勇，谢宗周，伊华林，郭文武*（华中农业大学园艺林学学院·园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉430070）摘要：【目的】从我国主要柑橘砧木实生后代中发掘自然发生的四倍体，希望获得一批同源四倍体砧木新种质。

【方法】秋季采摘柑橘砧木的成熟果实，剥取种子，温室播种，待种子萌发后，根据幼苗形态进行初选，用流式细胞仪对初选植株倍性检测，并通过SSR 标记鉴定其来源。

【结果】通过早期形态学观察及流式细胞仪分析，分别获得枳、早实枳、枳橙、香橙、大叶大花枳、河南枳、酸橘、枳柚、枸头橙和红橘等10个砧木类型的四倍体36、17、3、15、3、1、1、4、7、5株。

采用定位于甜橙9条染色体的27对SSR 多态性引物对获得的枳、早实枳、枳橙和香橙等4种砧木的四倍体的分子标记鉴定，表明它们均为同源四倍体。

【结论】挖掘出一大批柑橘砧木四倍体新种质，为多倍体砧木育种奠定了种质基础。

关键词：柑橘；砧木育种；同源四倍体；SSR 分子标记中图分类号：S666文献标志码：A文章编号：1009－9980(2014)01－0001－06Spontaneous generation and SSR molecular characterization of autote -traploids in ten citrus rootstocksLIANG Wu-jun ，XIE Kai-dong ，GUO Da-yong ，XIE Zong-zhou ，YI Hua-lin ，GUO Wen-wu *(College of Horticulture &Forestry Sciences ，Huazhong Agricultural University ，Key Laboratory of Horticultural Plant Biology ，Ministry of Education ，Wuhan ，Hubei 430070China)Abstract :【Objective 】The main objective is to explore spontaneous autotetraploids from main citrus root -stocks for potential tetraploid rootstock improvement.【Method 】Fruits were harvested in autumn ，seeds were extracted and sown in seed plot in greenhouse.Putative tetraploids were selected based on their mor -phology and then they were verified by flow cytometry.27SSR markers located in 9chromosomes of sweet orange were used to analyze the genetic origin of these tetraploids.【Results 】A total of 92tetraploid seedlings were obtained from all studied diploid genotypes i.e.36，17，3，15，3，1，1，4，7and 5seedlings from trifoliate orange ，early flowering trifoliate orange ，citrange ，fragrant orange ，big leaf big flower trifoliate orange ，Henan trifoliate orange ，sour tangerine ，citrumelo ，Goutou sour orange and red tangerine respectively.SSR analysis validated that the band profiles of tetraploids derived from diploid tri -foliate orange ，early flowering trifoliate orange ，citrange and fragrant orange were identical to their diploid maternal line.【Conclusion 】These autotetraploids hold great potential for both tetraploid rootstock breeding and basic research on stress tolerance of polyploids.Key words :Citrus ；Rootstock breeding ；Autotetraploid ；SSR (Simple Sequence Repeat)柑橘属于芸香科（Rutaceae ）柑橘亚科（Auran -tioidease ），是我国重要的经济果树树种之一。

ＳＳＲ技术在果树上的应用罗 球 张庆祥（江西省抚州市临川区茅排乡政府，江西抚州 344100）摘 要 在明确SSR技术原理、特点、优势的基础上，分析了SSR技术的应用步骤，并从果树种质资源研究以及构建分子标记遗传图谱两方面入手，阐述了SSR技术在果树上的应用，以此强调了SSR技术在果树研究中的重要作用。

关键词 SSR技术；种质资源；果树简单重复序列（SSR）是由几个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，这些序列具有保守性，在生物基因组中大量存在。

大量实践结果表明，SSR更容易被检测出来，在果树研究方面得到了广泛应用[1-2]。

１　ＳＳＲ技术的概述１．１　技术原理　对于SSR两端的序列来说，普遍为保守程度较高的单拷贝序列，基于此能够完成一对特异引物的构建，以此完成SSR-PCR，并实现串联重复序列的扩增。

在电泳的支持下检测扩增段的多态性现象，即实现SSR标记。

在当前的分析中，一般使用串联重复数的差异性完成相应的遗传分析，并实现对微卫星DNA长度多态性的显现。

１．２　技术特点　对于SSR技术来说，其在实际的应用中主要表现出以下特点。

①SSR的数量很多，普遍可以覆盖整个染色体组。

②具有明显的多等位基因特性，因此富含的信息量更多。

③在使用中遵循孟德尔遗传定律，呈现出共显性的特征。

④在实际的使用中对DNA数量以及纯度的要求较低，更容易实现PCR分析，且分析结果具备更优的重复性。

⑤引物序列的顺序完成，为实现交换提供更好的支持。

１．３　技术优势1.3.1 SSR技术与RFLP标记技术 RFLP标记技术是发展最早的DNA标记技术，在使用中需要利用限制性内切酶酶切DNA，并使用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段。

相较于RFLP技术来说，SSR技术在实际应用中的操作流程更为简单，且分析速度更快、多态性更强，同时可以完成基因组串联重复序列的检测，这是RFLP技术无法实现的，因此SSR技术有着更高的应用价值。

中国农业科学 2018,51(15):2969-2979 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.012收稿日期：2018-01-19；接受日期：2018-03-28 基金项目：国家自然科学基金（31720103915）、2018年农产品质量安全监管专项（111721301092361007）、广西柑橘新品种选育及无病毒苗木繁殖研究特聘专家岗位联系方式：李益，E-mail ：1946494060@ 。

通信作者邓子牛，E-mail ：deng7009@ 。

通信作者韩瑞玺，E-mail ：wudifeixue007@柑橘品种鉴定的SSR 标记开发和指纹图谱库构建李益1，马先锋1，唐浩2，李娜1，江东3，龙桂友1，李大志1，牛英4，韩瑞玺2，邓子牛1（1湖南农业大学园艺园林学院，长沙410128；2农业部科技发展中心，北京100122；3中国农业科学院柑桔研究所，重庆400712；4广西特色作物研究院，广西桂林541004）摘要：【目的】筛选出一套SSR 核心引物，用于构建柑橘品种的DNA 指纹图谱库，为柑橘种苗认证、品种登记和植物新品种保护提供技术支撑。

【方法】以柑橘属8个主要栽培种类为试材进行PCR 扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出多态性丰富、扩增条带稳定的引物对部分参试品种进行PCR 扩增，扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进一步的引物筛选；筛选得到的引物进行荧光标记，并选用部分柑橘品种进行PCR 扩增，扩增产物利用基因分析仪检测，分别计算各引物的PIC 值、等位基因数目，选取一套多态性丰富的适合进行荧光毛细管电泳检测的SSR 引物组合，进而对所有参试品种进行分析，构建柑橘品种的DNA 指纹图谱库，同时利用筛选的SSR 标记对参试品种进行鉴定。

【结果】初期以柑橘属8椪个种的代表品种（太田柑、沙田柚、沅江酸橙、大红甜橙、邓肯葡萄柚、枸橼、费米耐劳柠檬和墨西哥来檬）为材料，用362对SSR 引物进行PCR 扩增，扩增产物经4%琼脂糖凝胶电泳检测，初步筛选出80对种间多态性高、扩增稳定的SSR 引物；进一步从8个种类里选择不同类型的64个柑橘品种，用上述筛选出的80对SSR 引物进行PCR 扩增，扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，再筛选出60对品种类型间多态性高、扩增稳定、条带清晰的SSR 引物，并分别进行荧光标记；另以168份柑橘品种为材料对上述60对SSR 引物进行PCR 扩增，经荧光毛细管电泳检测，依据各引物的PIC 值、等位基因数目、峰图读取难易程度、扩增稳定性及染色体位置等，最终筛选出21对SSR 引物作为指纹图谱库构建的核心引物。