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PCR定义PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。
PCR技术的基本原理一、PCR反应成分：1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2+ 等。
二、PCR扩增过程1、高温变性(denaturation)在高温条件下，使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA变成单链DNA变性温度：94-97℃，30-50s2、低温退火(annealling)当温度降低时，由于模板分子的结构较引物复杂，且反应体系中引物的量大大多于模板DNA，使引物与其互补的模板在局部形成杂交链。
退火温度：25-60℃，常55℃60-90s，常60s3、适温延伸(extension)在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2 存在下，DNA聚合酶催化引物按5‟→3‟方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。
延伸温度：70-74℃，常72℃60-120s以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。
PCR反应体系中的各组分分析一、引物(primer)引物的设计决定PCR反应的成败PCR的效率和特异性取决于：1、引物与模板的特异结合2、聚合酶对引物的有效延伸引物设计原则1、引物长度以16-30bp为宜◆引物过短，特异性降低◆引物过长，成本增加，PCR的最适延伸温度会超过Taq DNA pol的最适温度◆若引物长8bp，则平均每隔48=65536bp就有一个结合位点。
人大约有43000个可能的结合位点◆若引物长16bp，则平均每隔416=4.29×109bp有一个结合位点。
QPCR原理及应用实时定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种快速、灵敏及准确的基因表达分析技术，它结合了聚合酶链式反应（PCR）和荧光探针技术，可以对目标基因在样品中的数量进行定量分析。
qPCR的原理：1.制备DNA模板：通过DNA提取技术，从感兴趣的样品中纯化出目标DNA。
2.PCR反应：将目标DNA及特异性引物和酶（聚合酶）放入PCR反应体系中，进行多个温度循环，使DNA的两条链分开，随后引物与DNA链特异性结合。
3.DNA合成：引物与DNA链结合后，酶开始合成新的DNA链，双链变为双链。
4.指数增加：经过多个PCR循环，目标DNA序列指数级增加。
5.荧光检测：利用荧光物质（荧光标记的探针）与PCR产物结合，通过荧光信号检测PCR产物的数量。
6.数据分析：根据荧光信号的强度，可以定量计算出目标DNA的初始数量，并进行数据分析。
qPCR的应用：1.基因表达分析：qPCR可以快速、准确地测量特定基因在不同样本中的表达水平，从而了解基因的功能及调控机制。
2.点突变检测：通过使用特异性引物和荧光标记探针，qPCR可以检测特定突变位点的存在与否，有助于基因突变的诊断和疾病的预测。
3.病原体检测：qPCR可以快速鉴定和定量病原体的存在，对于疾病的早期诊断、疫情监测有重要意义。
4.基因组拷贝数分析：qPCR可以快速、准确地测量基因组DNA的拷贝数变化，为研究基因组结构和进化提供重要线索。
5.表观遗传学研究：qPCR可以定量测量DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传学修饰的水平，有助于揭示表观遗传学的调控机制。
总结：qPCR作为一种高分辨率、灵敏度高的基因表达分析技术，在分子生物学和医学领域具有广泛的应用前景。
它可以快速、准确地定量测量目标DNA的数量，因此在疾病诊断、病因研究、基因功能分析等方面具有重要作用。
随着技术的不断发展和创新，qPCR将会在更多领域得到应用，为科学研究和临床诊断提供更多有价值的信息。
QPCR原理及应用QPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）即定量聚合酶链式反应，是一种可以对DNA进行定量检测的分子生物学技术。
通过测定DNA模版的初始数量，能够准确地对靶DNA在样品中的量进行定量分析。
QPCR技术已经广泛应用于医学、农业、环境科学等众多领域，并且在疾病诊断、基因表达研究、生物安全监测等方面具有重要意义。
QPCR的原理：QPCR主要基于DNA聚合酶链式反应（PCR）的原理。
PCR技术通过DNA聚合酶，利用DNA引物和酶切的DNA模板来扩增特定DNA序列。
在PCR的每一个循环中，DNA模板会被酶切成两段，然后引物结合到目标DNA上并扩增。
然后，扩增的DNA产物作为下一个PCR循环的模板，以此循环反复扩增。
在QPCR中，扩增的DNA产物通过酶的同步检测来实时监测。
QPCR使用一种荧光探针，在引物结合区域的扩增过程中释放出荧光信号。
荧光信号的强度与扩增DNA的数量呈正比。
通过检测荧光信号的强度，可以确定DNA的初始数量。
QPCR的应用：1.疾病诊断：QPCR可以快速、准确地检测疾病相关基因的表达水平，从而帮助进行疾病的早期诊断和病情监测。
比如，QPCR可以检测癌症相关基因的表达水平，辅助肿瘤的早期诊断和治疗。
2.基因表达研究：QPCR能够定量检测基因的表达水平，从而帮助研究基因在细胞和组织中的功能调控机制。
比如，研究在药物处理、细胞因子刺激等条件下，特定基因的表达水平的变化。
3.遗传病筛查：QPCR可以对遗传病相关基因进行定量检测，从而帮助进行遗传病的筛查。
通过检测特定基因的突变和表达水平，可以早期发现遗传病，并进行相应的干预和治疗。
4.放射性污染监测：QPCR可以快速、敏感地检测放射性物质污染的程度和范围。
比如，监测环境中的放射性同位素污染，以保护公众健康。
5.植物基因改良：QPCR可以帮助筛选目标基因在转基因植物中的表达水平。
通过检测基因的表达水平，可以确定转基因植物是否具有目标特性，从而加速植物基因改良的进程。
一、PCR扩增1．什么是PCR？聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR）是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。
2.PCR原理PCR技术是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催化作用，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸的循环过程，体外大量扩增特异DNA片段。
3．PCR程序通常有哪几个步骤、引物、耐热TaqDNA聚合酶、DNA模板、反应缓冲液、dNTP混合物、MgCl2水（1）引物设计与合成设计合成一对与目的DNA片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。
其中一引物与目的片段上游一条模板链的序列相互补，而另一引物与目的片段下游另一条模板链的序列相互补。
（2） DNA模板的变性加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。
（3）模板与引物的结合（退火或复性）解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。
（4）引物延伸将反应体系温度升到72℃左右，在Mg2+存在的条件下，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端（5’→3’方向延伸），使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。
4．引起PCR扩增的因素？(1)引物的质量与特异性；特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体;完整性：避免反复冻融;浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少.(2)PCR循环条件（变性温度和退火温度）；94-95 ℃ for 30-45 seconds；变性不完全,往往使PCR 失败，但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
通常PCR的退火温度选择为Tm- 5 ℃ ;退火温度越高,所得产物的特异性越高。
有些反应甚至可将退火与延伸两步合并，完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。
一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。
2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。
二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。
这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA 片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。
它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。
PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。
细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。
参与复制的有多种因素。
PCR 是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
三、实验试剂与器材模板DNA、2.5mmol/L dNTPTaq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2OPCR仪、移液枪、PCR板四、实验步骤1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA 2μL引物1 1μL引物2 1μLdNTP 1.5μLMgCl2 2μL10×buffer 2μLddH2O 10μLTaq酶0.5μL2、设置PCR反应程序。
聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，通过特定的引物和DNA聚合酶，将特定的DNA片段在体外进行快速、特异的扩增。
以下是PCR的原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、PCR的原理PCR技术的基本原理是通过对DNA的双链进行特异性解旋，然后在DNA聚合酶的作用下，以解开的每一条单链为模板，将特定的引物与单链的5’端和3’端结合，形成起始复合物。
在适宜的温度和条件下，DNA聚合酶将从引物3’端开始延伸DNA链，并通过反复变性-延伸循环，实现DNA片段指数级扩增。
二、所需试剂和耗材1.引物：用于与模板DNA结合，指示DNA聚合酶从何位置开始延伸。
引物可以是人工合成的寡核苷酸，也可以是从RNA或天然DNA中提取的。
2.DNA模板：被扩增的DNA片段的原始双链分子。
3.DNA聚合酶：催化DNA复制的酶，如Taq DNA聚合酶。
4.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
5.缓冲液：调节反应液的pH值，一般含有Mg2+离子以及其他辅助因子。
6.耐高温的DNA分离酶抑制剂：防止在高温下DNA被破坏。
7.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。
三、实验仪器1.基因扩增仪（PCR仪）：用于完成PCR的变性-延伸循环。
2.微量移液器：用于精确添加PCR反应液。
3.离心管：用于混合和离心PCR反应液。
4.水浴锅：用于PCR反应液保温。
5.电泳仪和电泳槽：用于分析扩增的DNA片段。
6.显微镜：观察细胞和组织样品。
7.分光光度计：用于测量DNA和RNA的浓度。
四、准备工作1.了解PCR的基本原理和步骤。
2.设计和制备引物：根据目的基因序列设计特异性引物。
3.准备基因组DNA或cDNA：从细胞或组织中提取基因组DNA或通过反转录制备cDNA。
4.缓冲液和其他试剂的准备：根据PCR试剂清单准备所有必需的试剂。
聚合酶链式反应的原理
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种在体外复制DNA序列的技术。
它基于DNA聚合酶的催化作用，通过反复进行DNA的变性、引物结合和扩增，从而大量复制
目标DNA序列。
PCR的原理包括以下几个关键步骤：
1. 变性（Denaturation）：将待扩增的DNA样本加热至高温
（通常为94-98°C），使 DNA双链解开成单链，使DNA分子的双链结构解开，断开了两个链之间的氢键结合，使得DNA
的链变为单链状态。
2. 引物结合（Annealing）：将反应体温度降低（通常在50-65°C之间），使DNA引物与待扩增序列的互补部分结合。
引物是一小段与目标DNA序列两端具有互补碱基配对的DNA
片段，可为DNA聚合酶提供起始序列。
3. 扩增（Extension）：在适合DNA聚合酶活性的温度下（通
常在60-72°C之间），DNA聚合酶结合引物的3'端，并在模
板DNA上合成新的DNA链。
该酶使用单链DNA作为模板，
应用碱基匹配规则将引物与模板DNA的互补碱基配对，并在
引物3'端依次添加适当的核苷酸，即进行DNA链的延伸。
以上三个步骤组成了PCR的一个循环。
每个循环都使目标
DNA序列得以扩增。
通过反复循环PCR的三个步骤，可以在
极短的时间内（通常数小时）从很小的起始DNA样本中扩增
出大量的目标DNA序列。
PCR技术在许多生物学研究领域得到广泛应用，包括基因测序、遗传突变检测、疾病诊断、DNA指纹鉴定等。
pcr的原理是什么PCR的全称是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种用于快速复制DNA片段的技术。
PCR技术的原理是通过不断循环的三步反应，将目标DNA片段进行指数级的增长，从而获得大量的特定DNA序列。
PCR技术的应用范围非常广泛，包括基因检测、疾病诊断、法医学鉴定、生物学研究等领域。
首先，PCR的原理基于DNA的复制过程。
在自然界中，DNA的复制是由一种叫做DNA聚合酶的酶催化的。
PCR技术模拟了这一自然过程，但是在实验室条件下进行，并且通过精确控制温度和添加特定的引物来实现目标DNA片段的扩增。
PCR的核心步骤包括变性、退火和延伸。
首先是变性步骤，将反应液中的DNA变性，使其解开双链，形成两条单链。
这一步通常在94-98摄氏度的高温下进行。
接下来是退火步骤，将反应温度降低至50-65摄氏度，引物结合到目标DNA的两端，形成引物-模板DNA复合物。
最后是延伸步骤，通过DNA聚合酶在60-75摄氏度的温度下，在引物的引导下合成新的DNA链。
这三个步骤循环进行，每个循环都会使目标DNA片段数量翻倍，从而实现指数级的扩增。
PCR技术的关键是引物的设计。
引物是一小段DNA序列，它们是PCR反应中的起始点，能够在目标DNA序列的两端结合。
引物的设计需要考虑到目标DNA的序列，确保引物能够特异性地结合到目标DNA上。
此外，引物的长度和碱基组成也需要精确控制，以确保PCR反应的准确性和高效性。
PCR技术的应用非常广泛。
在医学领域，PCR技术可以用于病原体的检测，包括病毒、细菌和真菌等。
在基因工程领域，PCR技术可以用于基因的克隆和定量。
在法医学领域，PCR技术可以用于犯罪嫌疑人的DNA鉴定。
在生物学研究中，PCR技术可以用于分子标记、种群遗传学和进化生物学等方面。
总之，PCR技术是一种非常重要的分子生物学技术，它通过模拟DNA自然复制过程，实现了DNA片段的快速扩增。
聚合酶链式反应PCR（Polymerase Chain Reaction）
目录
聚合酶链式反应PCR（Polymerase Chain Reaction） (1)
发展简史 (2)
技术原理 (2)
工作原理 (3)
反应特点 (3)
特异性强 (3)
灵敏度高 (4)
简便、快速 (4)
对标本的纯度要求低 (4)
PCR反应的分类 (4)
SOEing-PCR（重叠PCR）： (4)
RT-PCR（逆转录PCR）： (5)
简称PCR。
聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引
发展简史
人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。
20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。
但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。
Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。
但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。
1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR 技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。
从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。
但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。
1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。
尔后，Saiki等人又在黄石公园从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。
也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。
在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。
到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。
技术原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复
性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
工作原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
反应特点
特异性强
PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。
引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。
聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。
再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=10-6)水平。
能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速
PCR反应用耐高温的T aq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。
扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
PCR反应的分类
SOEing-PCR（重叠PCR）：
重叠区扩增基因拼接法，是基于普通PCR 技术衍生出的一种基因融合和定点突变的有效方法。
众所周知，由于引物只需要与模板有效结合，尤其是5’端序列不必与模板完全配对，因此扩增引物的5’端可以添加一种甚至是两种酶切位点，以便于后期克隆。
SOEing 法正是利用这一特点，向两个独立基因掺入一段新的序列以达到两个基因出现一个重叠区的目的，3’端的结合使基因融合或定点突变得以实现。
RT-PCR（逆转录PCR）：
RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
