鳗弧菌W-1金属蛋白酶基因真核表达载体的构建及其在动物细胞中的表达
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鳗 弧 菌 （ ｂｉ ａ ｇ ｉ ａ ｕ 是危 害 鱼 类 的 主要 Ｖｉ ｏ ｎ ｕｌ ｒ ｍ） ｒ ｌ 的条 件性病 原菌之在 也
在 动物 实验 中的免疫 效果 以及研 制鳗弧 菌金属 蛋 白酶 基 因疫 苗奠定 基础 。
养殖 鱼类 的重要病 原 菌 ， 给水 产 养 殖业 造 成 了较 大 的
ｔａ ｓｅ ｔｄ ６ ＨＥＫ２ ３ ｒ ｎ ｆｅｅ ． ９ Ｔ Ｔｒ ｎ ｆｅｅ ｗｉｈ ｐ ａ ｓｅ ｔｄ ｔ ＣＤＮＡ３ ．１（＋ ） ｍ— ／
ｅ ｍｐ Ａ７
图 ４ Ｗｅｔ ｎｂｏ 检 测 真 核 表 达 质 粒转 染的 ＣＩ 和 ｓｅ －ｌ ｒ ｔ ｌ Ｏ Ｈ Ｋ ９ Ｔ细 胞 中 ｍ ｅ Ａ Ｅ ２３ －ｍｐ ７的表 达
田
２０ｏ ７ｏ 亿 与生物 Ｚ程 ０，Ｉ ． １Ｖ． Ｎ２ ２
Ｃｈ ｍ ｉｔｙ ＆ Ｂｉｅｎ ｉｅ ｉ ｅ ｓｒ ｏ ｇ ｎ ｅｒ ｇ ｎ
鳗 弧 菌 Ｗ一 １金 属 蛋 白酶 基 因真 核 表 达 载 体 的构 建 及 其 在 动 物 细 胞 中 的 表 达
杨 慧 陈吉祥 张晓华 李 ， ， 。 筠 薛小 平 ，
ｈ ｔ ：／ ｅ ｉａ． ｋ ｃ ｓａｗ／ 件 与 ｍ ｅ Ａ７ ｔ ／ ｗｗｗ．ｂ． ｃｕ ／ｌ ｔｌ 软 ｐ ｕ —ｍｐ
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的 核酸序列 进行 比对 ， 结果证 实它 们的序 列完 全一致 。 ２ ２ 转染 细胞 中 ｍ－ｍｐ ． ｅ Ａ７基 因的转 录 采用 磷 酸 钙 法 将 重 组 质 粒 ｐ Ｄ Ｃ ＮＡ３ １ ＋ ） ｍ— ．（ ／ ｅ Ａ７转染 至 Ｃ ｍｐ Ｈ０ 和 ＨＥ ９ Ｔ 细 胞 中， Ｋ２ ３ 同时 以转
ｆｅｅ ｔ ＣＤＮＡ３ （ ） ｍ－ｍｐ ｅ ｔｄ ｗｉｈ ｐ ．１ ＋ ／ ｅ Ａ７
图 ３ Ｃ Ｏ 细 胞 和 Ｈ Ｋ ９ Ｔ细 胞 中 ｍ ｅ Ａ Ｈ Ｅ ２３ －ｍｐ ７ ｍＲ Ａ Ｒ ｏ Ｃ Ｎ Ｔ Ｐ Ｒ产 物 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析
Ｆｉ． Ａｇ ｒ ｓ ｅ ｌｃ ｒ ｐｈ ｒ ｓｓ ｆ ｇ３ ａ ｏ ｅｇ ｌｅｅ ｔｏ ｏ ｅ ｉ ｏｒＲＴ－ ＰＣＲ ｏ ｃ ｓｏ ｐｒ ｄｕ ｔ ｆ
基 金 项 目 ： 家 自然 科 学基 金 资 助 项 目（ ０ ７ １ ８ ３ ９ ２ ７ ） 国 家 ８ ３计 划 资助 项 目 （ ０ ７ 国 ３ ３ １ ０ ，０ ７２ ５ ， ６ ２ ０ ＡＡ０ Ｚ １ ） 国 家 ９ ３计 划 资 助 项 目 ９ ４６ ， ７
（ ００ ＣＢ１ ８ ２ ６ ０１ ０３）
，
２ ４ 讨 论 ．
Ｄ ＮＡ 疫 苗是 编码免 疫 原 或 与免 疫 原相 关 的 真核
表 达质 粒 ＤＮＡ（ Ｒ 或 ＮＡ） 它 可经 一 定途 径进 入 动物 ， 体 内 ， 动物宿 主细 胞摄 取 后 转 录 和 翻译 表达 出抗原 被
ＮＡ３ １（ ） ５ 。 。Ｋ２９ Ｔ ｎ ｒ ｎ ｆ ｅ ｅ ６ ＨＥＫ２ ３ Ｔｔ ｎｓ ． ＋ 。 Ｈ Ｅ 臻 ３ Ｕ ｔａ ｓｅ ｔｄ ． 。 一 一 ． ９ Ｔ ａ —
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染 空质粒 ｐ ＤＮＡ３ １ ＋） Ｃ ． （ 的细 胞 作空 白对 照 、 以未转 染 质粒 的正 常细 胞 作 阴性 对 照 ， 细 胞 转染 ３ 在 ６ｈ后 ，
收稿 日期 ： ０ ９ ｌ 一１ ２０ 一 ｌ ７
作者 简介 ： 慧 （９ １ ）女 ， 东青 岛人 ， 士 ， 师 ， 究 方 向 ： 生 物 学 与 免 疫 学 。Ｅ ｍａ ： ｉｙ ｈ ｎ ｕ ｅｕ ｃ 杨 １８一 ， 山 博 讲 研 微 － ｉ ｋｔ ｙ ＠ ｗｐ ．ｄ ．ｒ ｌ ｔ ｌ
外， 胞外 蛋 白酶也被认 为是鳗 弧菌与其 它许多 细菌病原
的 毒 力 因子 Ｄ￣６。Ｍｉｏ ｏ１ ３ ｌ ｎ等 ［］ 先 从 鳗 弧 菌 Ｎ Ｉ ｔ 】首 ４ Ｂ Ｏ中
质粒 ｐ Ｔ ４ （ ／ －ｍ Ａ７ 兔 抗 鳗 弧 菌 Ｗ－ Ｅ ２ ｄ ＋） ｍ ｅ ｐ 、 １金
属 蛋 白 酶 抗 体 ， 制 ；Ｃ Ｎ ． （ ） Ｔ ｚｌＲ ａ ｅ ｔ 自 ｐ Ｄ Ａ３ １ ＋ 、 ｆｏ ｅｇｎ ， ｉ Ｉｖｔ ｇ ｎ 司 ； 肠 杆 菌 Ｊ １９ 真 核 细 胞 系 Ｃ ｎ ｉｏ ｅ 公 ｒ 大 Ｍ ０、 ＨＯ 和
危害［ ］ １ 。鳗弧 菌 的致 病 性 与许 多毒 力 因 子 有关 ， 除 了 由 ６ ｂ质粒 ｐ Ｍ１编码 的铁 吸 收 系统ｌ ］ 细胞外 ５ｋ Ｊ ｌ 、 ３ “
ｌ 实验
１ １ 材 料 ．
溶血毒素［ ］脂 多糖 、 菌鞭 毛 蛋 白 ５ 、 ］细 川等 毒力 因子
（ ．西北 工业 大学 生命 科 学院 ， １ 陕西 西安 ７ ０ ７ ；．中国海 洋大学 海洋生命 学院 ， 东 青 岛 ２ ６ ０ ） １０２ ２ 山 ６ ０ ３
摘
要 ： 用 基 因克 隆 方 法 ， 带 有 突 变的 鳗 弧 茵 ｗ一 金 属蛋 白 酶 基 因的 原 核 表 达 质 粒 ｐ Ｔ２ ｄ ＋ ） ｍ－ｍｐ 采 以 １ Ｅ ４ （ ／ ｅ Ａ７为
酶 标记的山羊 抗 兔 ＩＧ， 汉博 士德 公 司 ； 内毒素 质 ｇ 武 除
粒 小量提取试剂 盒 ， 北京 天 根生 物工 程有 限公 司 ； 酸 磷
钙 法 质 粒 转 染 试 剂 盒 ， 云 天 生 物 工 程 有 限公 司 ； 转 碧 逆
录试剂盒 ， ｒｍｅａ 司 ； Ｍ、 ＭＥ 细胞培养 基 、 Ｐｏ ｇ 公 ＭＥ Ｄ Ｍ ＨａｋＳ ｎ 平衡 液 、 胎牛血 清和胰 蛋 白酶 ， ｉ ｏ公 司 ； 它 Ｇｂ ｅ 其 试 剂均为 国产生化试剂 或分析纯试剂 。
模 板 ， 过 Ｐ Ｒ 扩 增 得 到 ｍ－ｍｐ 基 因 ， 其插 入 ｐ ＤＮ ． （ ） 建 重 组 真 核 表 达 质 粒 ｐ Ｄ ３ １ ＋ ） ｍ ｅ ｐ ７ 通 Ｃ ｅ Ａ７ 将 Ｃ Ａ３ １ ＋ 构 Ｃ ＮＡ ． （ ／ －ｍ Ａ ；
然 后 用磷 酸 钙 法将 其 转 染入 动 物 细 胞 Ｃ ＨＯ 和 ＨＥ ９ Ｔ 中并进 行 瞬 时表 达 ， 别 以 Ｒ － Ｃ Ｋ２ ３ 分 Ｔ Ｐ Ｒ和 Ｗｅｔｒ－ ｌ 检 测 重组 ｓｅｎｂｏ ｔ 质 粒 的基 因 转 录和 蛋 白表 达 情 况 。结 果表 明 ， 功 将 突 变 的 鳗 弧 茵 ｗ－ 属 蛋 白酶 基 因 转 染 至 真 核 细 胞 中 ， 能 够 在 成 １金 并
动 物 细 胞 中 正确 地 转 录和 表 达 ， 为鳗 弧 茵基 因工 程 疫 苗 的研 制 奠 定 了基 础 。 关 键 词 ： 孤 茵 ｗ一 ； 属 蛋 白酶 ； 核 表 达 ； 因 疫 苗 鳗 １金 真 基 中 图分 类号 ： ８ Ｑ ７ 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ： ６ ２ ５ ２ （ ０ ０ ０ —０ ４ — ０ １７ ４ ５２ １ ） ２ ０ ２ ４
２８ｐ ４ ｂ
ｐａｍｉ ＣＤＮＡ３ （ ）ｍ－ｍｐ ｌｓ ｄｐ ．１ ＋ ／ ｅ Ａ７
。囊 ＿ 誊 薯ｊ
染 质粒 的对照 细胞 中未 见有 免疫 反应带 。
Ｍ．１ ０ｂ ２ ０ ｐ ＤＮＡ ｄ ｅ ｒ ｅ １ ＣＨＯ ａ ｓ ｅ ｔ ｄ ｗｉｈ ｐ Ｌａ ｄ ｒ ｍａ ｋ ｒ ． Ｔｒ ｎ ｆ ｃ ｅ ｔ ＣＤ—
３ ＣＨＯ ． Ｔｒ ｎ ｆｃｅ ｗｉ ｐ Ｄ ａ ｓｅｔ ｄ ｔ ｈ Ｃ ＮＡ３ １ （＋ ） ｍ—ｍｐ ． ／ ｅ Ａ７
ＨＥＫ２ ３ Ｔｒ ｎ ｆ ｃ ｅ ｗｉｈ ｐ ９ Ｔ ａ ｓ ｅ ｔ ｄ ｔ ＣＤＮＡ３ １（＋ ） ．
４ ．
５ ．ＨＥＫ２ ３ Ｕｎ— ９ Ｔ
陈吉祥 等ｒ ｌ 山东 沿 海 养 鱼 场 发 病 鱼分 离 的致 从
病性鳗 弧菌 Ｗ一 １的胞外 产 物 中分离 纯 化 了一 种金 属 蛋 白酶 ， 在原核 细胞 中克 隆 、 并 表达 了该酶 的基 因—— ｅ Ａ 基 因【 同时对 其 活性 中心 的 氨基 酸 残 基进 行 ｍｐ １ ， 了定 点突变 ［ １ 。序 列分析 结果 发 现 ， 序 列 同源 性较 其 高， 活性 位 点氨基 酸序 列 与其 它病 原 弧 菌有 较 大 的相 似度 ， 同血 清型 的鳗 弧 菌其 活性 中心 的 氨基 酸残 基 不 相同； 活性 实验结 果表 明 ， 变 的金 属蛋 白酶丧 失其蛋 突 白水解 活性 和细胞 毒性 ， 但仍 具有较 强 的免疫原 性 ， 因 此是一 个颇 具潜力 的鳗 弧菌 疫苗候 选抗原 蛋 白 。 作 者在 此 利 用 分 子 生 物 学 技 术 将 突 变 的鳗 弧 菌 Ｗ－ １金属 蛋 白酶基 因 ｍ－ｍ Ａ７克 隆入 真 核表 达 载体 ｅｐ 中， 使其 在 真核细 胞 中得 到表 达 ， 进一步 研究该 疫苗 为
蠢 ＮＡ３ ｉ ＋） ２囊毒 叠 ｔ ｎｆｃｅ ３ ＨＯ ｒｎｆｃｅ ｔ ． （ ．Ｃ ｒ ｓｅｔｄ ．Ｃ ＨＯ Ｕｎ ａ Ｔ ａ ｓｅｔｄｗｉ ｈ
ｐ ＤＮＡ３ １ ＋ ） ｍ－ｍｐ ４ Ｃ ． （ ／ ｅ Ａ７ ．ＨＥ ９ Ｔ Ｔｒ ｎ ｆｃｅ ｔ Ｃ Ｋ２ ３ ａ ｓｅ ｔｄ ｗｉ ｐ Ｄ— ｈ
１ ２ 方 法 ．
１ ２ １ 重 组 真 核 表 达 载 体 的 构 建 及 鉴 定 ． ．
根 据 已 突 变 的鳗 弧 菌 ｗ一 １金 属 蛋 白酶 基 因 ｍ—
ｅ Ａ７的碱 基 序 列ｆ］ 真 核 表 达 载 体 ｐ ＤＮ ． ｍｐ ｌ及 ８ Ｃ Ａ３ １ （ 多克 隆位 点 的序 列 ， 计一 对特 异性 引物 （ ６ ： ＋） 设 ＶＰ １
Ｆｉ ． Ｗ ｅ ｔｒ － ｌ ａ ｙ ｉ ｆＣＨ０ ｄ ＨＥＫ ２ ３Ｔ ｅｌ ｇ４ ｓｅ ｎ ｂｏｔａｎ ｌ ｓｓ ｏ ａｎ ９ ｃｌ ｓ
