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生化实验论文

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小鼠肝脏过氧化氢酶

的

制备与测定

小组成员：李 朋（10011140010）

邱方洲（10011140016）

武 浩（10011140020）

谢 黎（10011140022）

2010级一大班法医

2012年1月3日

小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定

过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。

小鼠肝脏过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。

《小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定》实验方案

实验目的

熟悉并掌握生化四大技术—离心、层析、比色、电泳。

熟悉并掌握分离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法。

实验原理

匀浆原理：分离纯化某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性，所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度很小，而脂质在有机溶剂中溶解度较大,通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中稳定性好，不易变性，而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差，容易变性。根据上述原理选择0.05mol/L，pH4.0醋酸-乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液，通过匀浆法破碎肝组织细胞，匀浆液离心后脂质分配到有机相中，部分杂蛋白则沉淀下来，而过氧化氢酶主要存在于上清制备过氧化氢酶匀浆盐析透析过氧化氢酶测定米氏常数值测定(Lineweaver -Burk双倒数作图法)蛋白含量测定(lowry法)纯度及分子量测定(SDS-PAGE)层析液中，分离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液。

盐析原理：蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低。通过向过氧化氢酶粗提液中加入适当浓度的中性盐,使过氧化氢酶呈盐析状态,而部分杂蛋白呈盐溶状态, 离心后过氧化氢酶主要存在于沉淀中，弃去上清收集沉淀，即可实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。

透析原理：采用20%乙醇、0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液、0.1mol/L NaCl溶液为透析液，对产物进行透析处理。在该透析条件下，过氧化氢酶溶解度变小，以沉淀形式析出，但不变性。透析过夜后离心，过氧化氢酶主要存在于沉淀中，但沉淀中也可能含有少量变性的杂蛋白。选择0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液复溶沉淀，则过氧化氢酶溶解，而变性的杂蛋白不能溶解，从而实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。

层析原理：凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各种物质分子扩散移动速度不同使混合物中各种物质得到分离的技术。采用sephadexG-200葡聚糖凝胶层析柱可以实现过氧化氢酶与其他分子量杂蛋白的分离，通过监测洗脱液在407nm（过氧化氢酶特征性吸收波长）和280nm波长下的光吸收值变化，合并收集OD407nm和OD280nm重叠峰值管，即可获得纯化后的过氧化氢酶。

米氏常数测定原理：底物浓度与反应速率之间的关系可用V=][][maxSKSVm表示，图形为矩形双曲线如下

将此式取倒数可得][][1maxSVSKVm，以V1和][1S作图可得一直线

由图可知该直线与横轴的截距为-mK1。找出一系列的点，将点还原为直线，即可求出Km

点的取法：设置不同的底物浓度，加入酶的量相同，反应相同的时间，找出反应后过氧化氢的量，分解的底物可以求得，用它来表示反应速率。剩余的过氧化氢用高锰酸钾滴定。

2KMnO4+5H2O2+3H2SO4=2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O

蛋白质浓度测定原理：蛋白质中的酪氨酸等与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。Lowry法测定蛋白质可分为两个步骤：

1、在碱性溶液中，蛋白质与铜离子发生反应Cu2++蛋白质→Cu-蛋白质

2、Cu-蛋白质使试剂中的磷钨酸-磷钼酸还原成为蓝色化合物，测定光吸收值就可以推算出蛋白质的含量。试剂中的碳酸钠有缓冲作用，使溶液的pH始终保持在10左右，显色最深。福林-酚法的灵敏度高、蛋白质浓度测定范围是25~250μg/ml.但此法实际上是蛋白质中酪氨酸和色氨酸等与试剂的反应，因此他受蛋白质氨基酸组成的影响，即不同蛋白质中氨基酸组成的不同会使显色强度有所差别；此外，样品中酚类及柠檬酸的干扰会使结果偏高。低浓度的尿素（约0.5%左右）、胍（约0.5%左右）、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯醋酸（0.5%）、乙醇（5%）、丙酮（0.5%）对显色无影响，上述物质浓度高时必须做校正曲线。

SDS-PAGE测定分子量原理：在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠SDS，则蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于分子量大小Mr，而与本身所带的电荷量和形状无关。具体公式:lgMW=(A+B)Rf

实验步骤：

(一)、组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液

1.颈椎脱臼处死6只小鼠，取肝脏约6g；

2.加入预冷匀浆缓冲液51ml,用组织捣碎机匀浆3min,取200μL，匀浆液留样放入冰箱-20℃保存；

3.冰浴下缓慢加入3ml氯仿，再次匀浆1min;匀浆液离心（4℃，7500rpm,30min）弃沉淀，收获上清液44ml于锥形瓶中；

4.取匀浆上清液120μL,加入40μL 4×电泳上样Buffer,沸水浴5min，备用于SDS-PAGE检测（-20℃保存），另取200μL匀浆后上清液-20℃保存。

（二）、盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶

1.冰浴搅拌状态下向肝脏匀浆上清液缓慢滴加7mlNa2SO4,继续用玻璃棒手动冰浴搅拌1h;

2.将盐析溶液离心（4℃，7500rpm,10min）弃上清保留沉淀;

3.用24ml磷酸缓冲液溶解沉淀15min，离心（4℃，5000rpm,10min）弃沉淀保留上清液;

4.取盐析后上清液120μL，用40μL 4×电泳上样Buffer，沸水浴5min,备用于SDS-PAGE检测，-20℃保存；

5.将透析袋至于沸水浴5min，清洗晾凉后备用；

6.将上清液放入透析袋中，置于透析液中两周，中途更换一次透析液；

7.两周后取透析袋中浑浊溶液离心（4℃，7500rpm，10min）弃上清保留沉淀;

8.用3ml磷酸缓冲液溶解沉淀15min,离心（4℃，4000rpm,10min）弃沉淀保留上清液;

9.取上清液120μL，用40μL 4×电泳上样Buffer制样沸水浴5min,备用于SDS-PAGE检测，于-20℃保存；

10.将透析袋至于沸水浴5min,清洗晾凉后备用；

11.将收获的上清液放入处理后的透析袋中置于75％的甘油中包埋浓缩2h，待样品浓缩至1.2ml收样，置于-20℃保存。

（三）、凝胶层析法进一步纯化过氧化氢酶

1.凝胶的处理（预先处理好）；

2.装柱（取一支层析柱，于底部填塞薄棉，将层析柱垂直夹于铁架台，于柱中加入缓冲液5cm，使用前将凝胶混匀顺玻璃棒缓慢注入柱中，待其自然下沉，凝胶床至少2/3柱高）;

3.平衡（磷酸缓冲盐溶液流洗，控制流速5-10滴/min）;

4.浓缩样品；

5.加样（用吸管吸取待分离的浓缩液1.2ml,在接近凝胶床表面处沿柱壁缓慢加入）；

6.洗脱（用磷酸盐缓冲液保持流速）；

7.收集及检测（样品下降至底部5cm开始用试管收集流出液，每管收集2ml,收集管依次在407nm和280nm波长下测吸光度值，绘制洗脱曲线）；（如图1）

8.收获纯化产物（收集OD407nm和OD280nm重叠峰值管）；

9.取2ml纯化后存样于-20℃保存，备于蛋白质浓度和Km值测定；

10.取层析样品60μL，用20μL 4×电泳上样Buffer制样，沸水浴5min,备用于SDS-PAGE检测，于-20℃保存。

（四）、Lowry法测定纯化的过氧化氢酶浓度

1.选择标准蛋白:选择与待测样品（层析后的纯化样品）相同或组成类似的蛋白质作为标准蛋白溶液。

2.标准蛋白溶液的配制:将标准蛋白经凯氏定氮法准确测定其蛋白质含量，再用无离子水配制成0.1mg/ml的储存液。

3.实验结果表1所示配成不同浓度的标准蛋白组，编上号码，以第一管为空白管，在分光光度计上测定650nm处的光密度值。

4.以各标准溶液浓度为横坐标，各管的光密度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。（如图2）

5.测定样品蛋白:取试管两支，一支放1ml稀释的层析后纯化样品和1ml试剂AB混合液，另一支放1ml生理盐水和1ml试剂AB混合液，两者均混匀后在50℃水浴保温10分钟，冷却，再各加入试剂C 3ml立即混匀，置于50℃水浴中保温20分钟，冷却后测定650nm波长处的光密度值。

（五）.双倒作图法测定纯化的过氧化氢酶米氏常数

1.稀释匀浆后和层析后样品各1000倍（5μL-5ml）

2.过氧化氢的浓度再标定:取清洁锥形瓶2支，各加0.04mol/L的过氧化氢溶液2.0ml和25％硫酸2.0ml。分别用0.002mol/L高锰酸钾滴定至微红，记录滴定毫升数去平均值，计算过氧化氢的摩尔浓度。

3.反应测速:取干燥的50ml锥形瓶5只，编号后操作。终止反应：血液加入后立即计时10分钟，到时立即加入25％硫酸2.0ml,边加边摇，终止酶促反应。

4.滴定:用标准0.002mol/L高锰酸钾滴定，记录各瓶耗高锰酸钾的ml数。

5.计算

（1）.反应瓶中过氧化氢浓度计算

［S］=H2O2摩尔浓度*H2O2的ml数/3.0

（2）.反应速度计算

V=H2O2的摩尔浓度*加入H2O2毫升数-0.002*2.5*消耗KMnO4的ml数

=加入的H2O2的毫摩尔数-剩余的H2O2的毫摩尔数

（3）.求Km值 （如图3）

（六）.SDS-PAGE法测定纯化的过氧化氢酶分子量

1.凝胶的制备：(预先处理好)

2.蛋白质 样品的处理：将蛋白质溶解在蛋白质样品溶解液中，在100℃加热2-5分钟。蛋白质的最后浓度一般为0.05-1mg/ml.

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探讨临床血液样本放置时间对生化检验结果的影响.

探讨临床血液样本放置时间对生化检验结果的影响.

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Hubei University of Chinese Medicine

本科毕业论文

题 目：探讨临床血液样本放置时间对

生化检验结果的影响

姓 名： 陈孝琴

指导老师： 陈仕银

学 号： 20090401150

专 业： 医学检验

年 级： 2009级

实习单位： 四川省广安市人民医院

完成日期： 2013 年 4 月 15 日

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学位论文作者声明

本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。

本人完全了解有关保障、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关学位论文管理机构送交论文的复印件和电子版。同意本论文被编入有关数据库进行检索和查阅。

本学位论文内容不涉及国家机密。

论文题目：探讨临床血液样本放置时间对生化检验结果的影响

实习单位：四川省广安市人民医院

作者签名：

指导老师：

2013年 4 月 15日

3 目录

一、中文摘要---------------------------------------------------------------------------3

二、英文摘要---------------------------------------------------------------------------3

三、正文---------------------------------------------------------------------------------5

生化实验

生化实验

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生物化学实验指导书（精简本）

11 第一部分 生理生化实验目的要求

一、实验课的目的

植物生理生化实验课在我院作为一门独立的课程开设。通过实验课，学生可验证和巩固课堂理论知识，初步掌握有关植物生理生化的实验方法和操作技术，培养分析问题和解决问题的能力。

二、实验教学安排及评分方法

根据教学大纲及各类学生的不同要求，对本科生开设5个单位时间的实验内容既有定量的，又有定性实验。本科生成绩按百分制计算，实验课成绩主要按（1）预习报告（包括提问）；（2）操作；（3）实验结果和结果分析；（4）思考题；（5）态度（包括卫生情况）方面进行综合评分，侧重操作和结果。

三、实验课的具体要求

（一）植物生理生化实验的要求

1、充分预习：预习是做好实验的关键，实验前必须详细阅读实验指导，参考有关理论知识，弄清原理，了解实验过程中的各个环节，注意事项及其仪器使用方法，在自己所备的预习报告书上写一简单提纲，内容包括（1）原理；（2）实验步骤；（3）注意事项等，教师课前检查预习报告，发现不做预习报告者一律不给予做实验。

2、认真操作：严格地按照实验步骤独立进行操作，掌握每个实验地关键，明确操作原理，同事细心观察实验中出现的现象。若对实验步骤、材料等有不同看法，提出修改者，需在预习报告中写明，取得老师同意后，方可进行。

3、详细记录实验结果：每次实验过程中，应及时、详细地记录自己实验的一切数据及现象，杜绝抄袭等现象，一经发现该次成绩按0计算。在实验结束后，应交上一份原始记录，经老师阅后，再洗仪器，切记先清洗仪器，以免发现有错时，难以弥补。

4、认真写好实验报告：实验结束后，按照自己的实验结果及老师布置的思考题独立写好实验报告，文字要求简练、明了、准确。实验报告必须独立完成，发现抄袭者、抄袭者和被抄袭者，一律不给予评分。

（二）生理生化实验室规则

1、参加实验者，一律穿鞋进入实验室，实验室禁止抽烟，对待实验操作应认真严肃，并且冷静思考问题，不得在实验室谈笑，喧哗！

生物化学创新型实验教学模式之研究论文

生物化学创新型实验教学模式之研究论文

浅谈生物化学创新型实验教学模式之研究

【摘要】生物化学是生物与制药工程类专业学生必修的课程之一，为了能够更好的调动学生的学习积极性和培养学生的综合实验能力，南京工业大学自创了一套以“开放、滚动、自主”为主轴的实验教学方法，为高校生物化学实验的教学改革提供了新的思路。

【关键词】开放实验 滚动实验

由于生物化学实验技术的不断发展，使得实验教学也要适应新形势下的新要求，加强对学生基本技能和科研素质的培养。以黄冈中学（第五师分校）生物化学实验为例，通过多年的实验室教学研究，创新性地开发了一套以“开放、滚动、自选”为主轴的实验教学方法，使学生的综合能力得到显著提高。在对近5年毕业生的跟踪调查中获知，学生的实验综合能力得到了社会、企业的全面认可，不少学生已经成为了企业和研发单位的科研中坚力量，这也是对大家多年努力的肯定。现将这种新型教学方法作简要介绍。

1开放性实验教学模式

传统的生物化学实验在时间上都是由学校统一安排，学生按照课表进行实验。这种安排缺乏灵活性，学生在实验时间的选择上是被动的。开放性实验室时间向学生开放，使学生有更多时间来完成自己的实验，这种时间上的灵活性无疑给学生自主学习和研究提供了很方便的条件。 开放时间进入实验室进行实验，必须在实验预约系统中进行预约，实验中心有建设良好的网站，学期初实验教师将实验室开放时间公布在网络上，每位同学登陆后可以根据自己的情况进行预约，待老师批准后即可按照预约的时间前往实验室。另外实验中心的门禁系统正在安装调试过程中，待门禁系统投入使用后，实验室的开放管理工作将更加规范和安全。

因为学生时间的开放性，对实验中心的教学难度和工作细致度提出了更高的要求，为此实验中心建立了一套健全和完善的规章管理制度，学生进入实验室前都必须接受安全教育，知晓各项规章制度；实验室管理人员必须将药品分类整理摆放，并由专人保管钥匙。高精仪器必须放置在温度、湿度合适的洁净房间，每次使用后填写仪器使用记录单。因为开放式实验的特点，实验前需要配制的试剂特别多，管理起来也比较麻烦，所以需要实验室管理人员有强烈的责任心和耐心，每次开放实验室前，必须检查试剂用量及仪器完好情况，关闭实验室前必须整理试剂，检查仪器使用状况。有了这些充分的准备，就能很好地保障实验教学工作的顺利进行。

生化、制药专业毕业论文文献综述综述

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2013届制药工程专业毕业论文—文献综述

1 微污染物-微生物活性的微流控芯片直接检测

1. 研究的目的和意义

环境监控已越来越为人们所需要，这就要求有合适的实时检测设备。微流控芯片（Microfluidic Chip）将化学、生物、医学等领域所涉及的样品的选择、制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一个几平方厘米（甚至更小）的微芯片上，通过微通道结构来控制流体流动，从而完成不同的化学或生物反应过程，并对其产物进行分析，它为生化分析新局面的开创提供了一个新的研究平台。通俗点，就是将实验室搬到微芯片上，微流控芯片为环境监控提供了一种合适的分析监测设备。本文介绍了以色谱纸为基材制作了纸基微流控芯片的基本概况、芯片的发展现状、芯片的制作、芯片检测方法，并将纸基微流控和微污染物-微生物的活性相结合，对微污染物-微生物活性的微流控芯片直接检测进行了初步研究。

2. 微流控芯片的基本概况

一种新兴的芯片技术——微流控芯片技术以其快速分析、低消耗、微型化和自动化等特点发展非常迅速。微流控芯片（又称芯片实验室）是一种以在微米尺度空间对流体进行操控为主要特征的科学技术。它具有将化学和生物实验室的基本功能微缩到一个几平方厘米芯片上的能力，已经显示了重要的应用前景。该技术是在分析化学领域发展起来的，它以分析化学为基础，以微机电加工技术、微流体驱动或者控制、检测技术为依托，以微通道网路为结构特征，以化学和生命科学为主要应用对象，把整个实验室的功能集成到芯片上，而且制作简便，作为一种新兴的科学技术，微流控研究已经涉及化学、生物学、工程学和物理学等诸多领域，学科交叉性强，分析化学则是其第一轮也是最直接的一个应用领域[1]。近年来，微流控研究发展迅速，技术创新层出不穷，应用领域不断拓宽。 微污染物—微生物活性的微流控芯片直接检测

2 3. 微流控芯片的发展现状

微型全分析系统（Miniaturized Total Analysis Systems,μ-TAS）的概念是1990年Manz和Widmer等人首次提出来的，目前已经发展为世界上最先进的科学技术之一。微型全分析系统（Miniaturized Total Analysis