包涵体纯化方案
缓冲液配方：
1.变性复性缓冲液
缓冲液A：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA ①
, 100mM NaCl②,1%Triton
X-100③
缓冲液B：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100，
2M脲素④
缓冲液C：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100 缓冲液D：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100，
2M盐酸胍④
溶解缓冲液E：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，10mM β-巯基
乙醇/DTT ⑤
，2mM脱氧胆酸钠
⑥
，8M脲素
复性缓冲液：50mM Tris-HCl (pH8.5)，100mM NaCl ，6M/4M/2M脲素,1%甘氨
酸⑦
，5%甘油
⑧
，0.2%PEG
⑨
，1mM氧化型谷胱甘肽，1mM还原型谷
胱甘肽
⑩
2.纯化缓冲液
Binding buffer：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM 咪唑，pH8.5
Elution buffer：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 不同浓度梯度咪唑, pH8.5
具体实施步骤：
1.大量诱导表达的菌液7000rpm离心10min。弃上清，用1×PBS重悬，洗涤菌体细胞，7000rpm，离心10min。再用PBS重复洗一遍。离心后留菌体沉淀。
2.将菌体细胞用缓冲液A重悬，液氮中反复冻融后，超声破碎。13000rpm离心10min，弃上清，收集包涵体沉淀。
2.分别用缓冲液B、C、D超声清洗包涵体沉淀。13000rpm离心10min收集沉淀。
3.用缓冲液E溶解包涵体，缓慢摇动使其缓慢溶解，室温放置30min，然后13000rpm离心10min。取上清。
4.将上清稀释至0.1-1.0mg/ml，装入透析袋中，放置于梯度复性缓冲液中，4℃缓慢透析24-36h。最后在纯化binding buffer中透析，确保蛋白稳定可溶。
5.对溶解的包涵体蛋白进行亲和层析。
附注：
①EDTA防止蛋白降解
②NaCl一定的盐离子可降低某些带电基团间的斥力
③Triton X-100除去其他细菌成分，如膜外蛋白，质粒DNA和其他杂质
④脲素，盐酸胍，洗掉包涵体表面的不溶性杂蛋白
⑤β-巯基乙醇/DTT作为还原剂打开错配的二硫键
⑥脱氧胆酸钠作为离子型去垢剂能促溶蛋白
⑦⑧甘氨酸、甘油促溶
⑨PEG可逆修饰折叠中间体的疏水基团
⑩氧化型和还原型谷胱甘肽促进二硫键的形成。
(11)1g菌使用35ml液体重悬即可。
